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  作者：張蓓，楊曉云，劉蕊，紀鳳祥

【關鍵詞】  常規檢查；,,HBV-DNA；,,熒光定量PCR

　　摘要：目的：探討HBV-DNA的檢出情況與乙肝兩對半結果之間的關系。方法：運用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測307例疑似乙肝患者血清中的HBV-DNA，同時運用ELISA方法進行兩對半指標的檢測，并對結果進行相關性探討。結果：HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)組（大三陽組）患者血清HBV-DNA檢出率為98.15%（53/54），平均拷貝數為7.56E+06/ml；HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)組（小三陽組）患者血清HBV-DNA檢出率為27.78%（15/54），平均拷貝數為3.79E+05/ml；HBsAg(+)HBcAb(+)組血清HBV-DNA檢出率為91.18%（31/34），平均拷貝數為2.85E+05/ml，小三陽組HBV-DNA陽性檢出率及拷貝數均低于大三陽組，且與大三陽組比較均具有顯著性差異（P<0.01，P<0.05）；HBsAb(＋)組血清HBV-DNA檢出率為1.6%(1/63)，平均拷貝數為1.13E+08/ml ；HBcAb(+) 組血清HBV-DNA檢出率為16.67%(1/6)，平均拷貝數為3.00E+04/ml；HBsAb(＋) HBeAb(＋)HBcAb(＋)組血清HBV -DNA檢出率為12.50%(4/32)，平均拷貝數為3.00E+05/ml；HBsAg(+)組血清HBV-DNA檢出率為0（0/2）；HBV-M全陰性組HBV-DNA檢出率為1.61%（1/62），平均拷貝數為2.75E+05/ml。結論：HBV-M陰性患者仍有HBV-DNA陽性者，因此在檢測中應聯合應用兩種方法進行檢測，提高檢出率，避免漏診，為臨床HBV感染、復制及傳染性的判斷以及指導治療提供更為可靠的判定依據。

　　關鍵詞：  常規檢查；  HBV-DNA；  熒光定量PCR

　　Correlation of Detection of HBV-DNA by Fluorescent Quantitative PCR with Routine Detection of HBV

　　Abstract：Objective：To explore the relationship between detection of HBV-DNA and routine detection of HBV.Method：HBV-DNA was detected with fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) and HBV was routinely determined with ELISA in serum samples from 307 suspected cases of hepatitis B.Meanwhile ,the correlation of results between the two methods was analyzed.Result：The detecting rate of HBV-DNA was 98.15% (53/54) and the mean copy number was 7.56E+06/ml in patients of  HBsAg(+),HBeAg(+) and HBcAb(+) (group A), 27.78%（15/54）and 3.79E+05/ml in patients of HBsAg(+),HBeAb(+) and HBcAb(+) (group B), 91.18%（31/34）and 2.85E+05/ml in patients of  HBsAg(+) and HBcAb(+) (group C).The 2 parameters were significantly lower in group B than in group A(P<0.01 and 0.05).Furthermore,they were respectively 1.6%(1/63) and 1.13E+08/ml in patients of HBsAb(＋), 16.67%(1/6) and 3.00E+04/ml in patients of  HBcAb(+),12.50%(4/32) and 3.00E+05/ml in patients of HBsAb(＋), HBeAb(＋) and HBcAb(＋),0(0/2) in patients of HBsAg(+) and 1.61%（1/62）and 2.75E+05/ml in HBV-M- negative patients.Conclusion：HBV-DNA positivity may appear in HBV-M- negative patients.Therefore,the 2 methods should be simultaneously used in the detection of HBV infection to promote the detecting rate to provide more reliable evidence for judgment of HBV infection,duplication and infectivity and its treatment in clinical practice.

　　Key words：  Routine detection;  HBV-DNA;  Fluorescent quantitative PCR

　　乙型肝炎是世界上最常見的傳染病之一，世界衛生組織(WHO)估計，本病每年造成100萬人死亡［1］。慢性乙型肝炎是HBV感染的一種嚴重后果。HBV-DNA是直接反映乙肝病毒存在、活動性復制及具有傳染性的可靠指標［2］。但目前我國現狀HBV感染者多以其血清感染標志物（乙肝兩對半，HBV-M）判定，由于其組合模式復雜多樣，從而導致了臨床上對部分發病患者的HBV感染復制狀況難以判斷，有時甚至會出現漏診的情況。定量PCR法的應用，使得我們進行HBV-DNA的檢測的同時得以對其進行相對的量化，這對于乙肝患者體內的HBV的復制以及傳染性有更直接的了解，同時也更有利于對臨床HBV感染的診斷、治療方案的選擇及療效的判斷。本文采用熒光定量PCR(FQ-PCR)對307例疑似乙肝患者標本血清的不同HBV血清學標志物組合進行了HBV-DNA檢測，并對結果進行了統計學處理，以探討HBV-M與HBV-DNA復制水平的關系，現報告如下：

　　1  資料與方法

　　1.1  標本來源：均系2004年7月至2005年8月到我院就診的所有同時做過乙肝兩對半及HBV-DNA檢測的疑似乙肝的門診和住院患者，共307例，其中女129人，男178人，年齡17～78歲，平均39歲。

　　1.2  檢測儀器

　　1.2.1  LightCycler定量擴增儀（德國）。

　　1.2.2  Alisei全自動酶標儀（德國）。

　　1.3  檢測方法和試劑

　　1.3.1  HBV-M檢測：用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)檢測，試劑由上海榮盛生物技術有限公司提供，并嚴格按說明書操作。

　　1.3.2  HBV-DNA定量分析：采用熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測，試劑由上海復星醫學科技發展有限公司提供，嚴格按說明書的步驟進行操作。

　　1.4  統計學處理：根據HBV血清標志物分為8組，將各組的HBV-DNA拷貝數進行對數變換，以指數表示(±S)，定量測量范圍仍用實際檢測值表示；采用X2檢驗進行組間HBV-DNA陽性率顯著性檢驗，采用兩樣本均數的t檢驗比較拷貝數。

　　2  結果

　　2.1  HBV-DNA定量測定結果：307例疑似乙肝患者血清標本中，106例HBV-DNA陽性，201例陰性，陽性最低拷貝數為1.30E+03copy/ml，最高拷貝數為7.70E+09copy/ml。

　　2.2  HBV-DNA定量測定與HBV-M的關系，見表1。

　　表1  ELISA法檢測HBV-M和熒光定量PCR檢測HBV-DNA結果（略）

　　注：*與大三陽組比較P<0.01，#與大三陽組比較P<0.05

3  討論
 　　
　　FQ-PCR是進行臨床基因診斷的有效手段，它采用了完全閉管檢測，不需要PCR后處理，避免了交叉感染；同時采用實時檢測技術，所得Ct值和原始模板數量完全呈線形相關，定量準確率極高［3］，它不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應用，可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜的高精確性，克服了常規PCR的許多缺點［4］。
　　
　　ELISA法檢測乙肝兩對半是臨床診斷HBV感染的傳統手段，它檢測的是人體對HBV的免疫反應狀態，而FQ-PCR則可以準確的反應出HBV-DNA的復制水平、病程變化和治療恢復情況等。本文結果顯示，54例大三陽組中，其HBV-DNA陽性53例，檢出率達98.15%，而且呈較高的拷貝量，經統計學處理大三陽組和HBsAg(+)HBcAb(+)組與小三陽組有顯著性差異，說明這些患者HBV具有較高的復制水平，是具有傳染性的重要標志。
 　  
　　54例小三陽血清中15例檢出HBV-DNA陽性，檢出率為27.78%，平均拷貝數達到3.79E+05拷貝數/ml，雖然其拷貝數和陽性率均低于大三陽組，但仍然具有較強的傳染性，說明HBeAb的存在并不表示患者體內沒有病毒復制，與既往文獻報道結果吻合。
　　
　　在34例HBsAg(+)HBcAb(+)血清中，有31例檢出HBV-DNA陽性，檢出率為91.18%,平均拷貝數為2.85E+05/ml，提示該組中的病人仍具有較強的病毒復制，傳染性強，此情況可能為血清轉換期或前C區突變，如果經過動態觀察，仍表現HBsAg(+)HBcAb(+)及HBV-DNA陽性，可能為前C區突變［5］。
　　
　　在63例HBsAb(+)血清中，仍檢測出1例HBV-DNA陽性，檢出率為1.6%，平均拷貝數為1.13E+08拷貝數/ml，6例HBcAb(+)血清中1例檢出HBV-DNA陽性，檢出率為16.67%，平均拷貝數3.00E+04拷貝數/ml，說明HBsAb產生和HBeAg轉陰并不意味著病毒的復制停止或減弱。有學者認為此現象有可能與HBV-DNA前C區發生突變有關，出現“免疫逃逸”或不同亞型的HBV重疊感染［6］。也有學者證明乙型肝炎HBsAb出現后，血清內仍有DNA復制，隨著時間的推移HBV-DNA的檢出率逐漸下降［7，8］。
　　
　　62例乙肝兩對半全陰性的病人中仍有1例HBV-DNA陽性，平均拷貝數為2.75E+05拷貝數/ml，陽性率為1.61%，據國內外文獻報道證實HBV-DNA的出現早于其他血清標志物，因此該l例受檢者可能處于早期感染［9］。乙肝兩對半標志物全陰性的病人不能排除HBV感染。因此PCR的高靈敏度可作為早期診斷HBV感染提供依據，提示在臨床上對HBV-M均陰性者，有進一步進行HBV-DNA、FQ-PCR檢測的必要，以確立有無HBV感染。
 　　
　　綜上所述，本研究結果表明，PCR與ELISA兩種方法檢測HBV感染與復制，多種血清學標志物模式都有一定的HBV-DNA檢出率，由于DNA陽性表示HBV在體內復制，如果僅以HBV-M的檢測結果作為判斷HBV-DNA感染、傳染性以及HBV是否在體內復制有一定的局限性，因此，為臨床提供HBV感染、復制及傳染性判斷以及指導治療和觀察療效，我們應選擇乙肝兩對半標志物并同時做HBV-DNA的熒光定量PCR檢測。

　　參考文獻：

　　［l］  Davey S.State of the World’s Vaccines and Immunization［Ｍ］.Geneva:World Health Organization,1996．76.

　　［2］  彭文偉,主編.病毒性肝炎研究［M］.廣州:廣東科技出版社,1998．3.

　　［3］  程剛,何蘊韶,周新宇.熒光定量聚合酶鏈反應檢測乙型肝炎病毒［J］.中華醫學檢驗雜志,1999,22(3):135.

　　［4］  孫靜,陳曲渡,張林林,等.乙肝標志物模式與HBV-DNA定量的分析比較［J］.現代中西醫結合雜志,2002,11(8):750.

　　［5］  Rodriguez FF,et al.Hepatitis virus infection:precore mutants and its relation to viral genotypes and core mutations［Ｊ］.Hepatology,1995,22:1641.

　　［6］  陳素玲,胡國齡,譚德明.381例HBV感染者HBV-DNA前C區基 因突變的研究［J］.中國現代醫學雜志,2001,l(8):48-50.

　　［7］  王國義,李雷,陳自平.慢性乙型肝炎病變活動與血清HBV-DNA含量的關系［J］.中國現代醫學雜志,2001,1(10):102.

　　［8］  Loriot MA,MarcellinP,Bismuth E,et al.Demonstration of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction in serum and the liver after spontaneous or therapeuticauy induced HBeAg to anti-HBe or HBeAg to anti-HBs,seroconversion in patients with chronic hepatitis B［Ｊ］.Hepatology,1992,15(1 ):32-36.

　　［9］  雷學忠,趙建勤,劉麗,等.熒光定量檢測HBV-DNA與乙肝兩對半結果對比分析研究［J］.四川醫學,2001,21(11):949.

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