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本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。 細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法結果為準。
細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示。
細菌內毒素國家標準品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。
細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及設置的各種陽性對照。
凝膠法細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。定量測定用的細菌內毒素檢查用水，其內毒素的含量應小于0.005EU/ml。
試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分鐘，也可用其他確證不干擾細菌內毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應防止微生物的污染。
供試品溶液的制備 某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0-8.0的范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節被測溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產廠家推薦的適宜的緩沖劑調節PH值。酸或堿溶液須用檢查用水在已去除內毒素的容器中進行配制。緩沖液必須經過驗證不含內毒素和干擾因子。
內毒素限值的建立 藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：
L=K/M
式中L為供試品的細菌內毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；
K為人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5E U/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，鞘內用注射劑K=0.2 EU/(kg·h)。
M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U/ (kg·h)表示，人均體重按60kg計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。
按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。
確定最大有效稀釋倍數（MVD） 最大有效稀釋倍數是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數，在不超過此稀釋倍數下可進行內毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD：
MVD=CL/λ
式中L為供試品的細菌內毒素限值；
C為供試品溶液的濃度，當L以EU/ml表示時，則C等于1.0ml/ml，當L以EU/mg或EU/U表示時，C的單位需為mg/ml或U /ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，計算供試品的最小有效濃度C=λ/L。
λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。
方法1 凝膠法
凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。
鱟試劑靈敏度復核試驗 當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。
根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取含有分裝了0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復溶后的0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內毒素標準溶液，及每一個濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。
將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°時，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。
若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc).
λc=1g-1(∑X/4)
式中X為反應終點濃度的對數值（1g）。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。
當λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。
干擾試驗 按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。
只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時，試驗方為有效。按下式計算C和B的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。
Es= 1g-1(∑Xs/4)
Et= 1g-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的對數值（1g）。
當Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5 Es和2 Es)時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。
表1 凝膠法干擾試驗溶液的制備
注：A 供試品溶液；B干擾試驗系列；C鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D陰性對照。
可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。
當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。
當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。
檢查法
1）凝膠限量試驗
按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數為MVD并且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。
表2 凝膠限量試驗溶液的制備
注：A供試品溶液；B供試品陽性對照；C陽性對照；D陰性對照。
結果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀察結果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。
若溶液A的兩個平行管都為陰性，判供試品符合規定；若溶液A的兩個平行管均為陽性，判供試品不符合規定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性另一管為陰性，需進行復試。復試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規定；否則判供試品不符合規定。
2）凝膠半定量試驗
本方法系通過確定反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。依表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。
結果判斷 若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.5λ-2λ之間，試驗有效。
系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，為每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度（按公式CE=1g-1(∑X/2)）。如果試驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘上稀釋倍數。
如試驗中供試品溶液的結果都為陰性，應記為內毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記錄為小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數）。如果結果都為陽性，應記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。
若內毒素濃度小于規定的限值，判供試品符合規定。若內毒素濃度大于或等于規定的限值，判供試品不符合規定。
表3 凝膠半定量試驗溶液的制備
注：A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。用檢查用水進行2倍系列稀釋，從通過干擾試驗的稀釋倍數開始再稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，但隨后的稀釋也不得超過MVD；
B：含2λ濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽性對照）；
C：含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ濃度標準內毒素的檢查用水系列；
D：陰性對照。
方法2 光度測定法
光度測定法分為濁度法和顯色基質法。
濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，可分為終點濁度法和動態濁度法。終點濁度法是依據反映混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關系來測定內毒素含量的方法。動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。
顯色基質法系利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，分為終點顯色法和動態顯色法。終點顯色法是依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的有色團的量之間存在著量化關系來測定內毒素含量的方法。動態顯色法是檢測反應混合物的色度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測色度增長速度的方法。
光度測定試驗應在特定的儀器中進行，溫度一般為37℃±1℃。
供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。
為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進行標準曲線的可靠性試驗以及供試品溶液的干擾試驗。
標準曲線的可靠性試驗 當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。
用標準內毒素配成溶液，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性對照。當陰性對照在設定的時間內不發生反應，將全部數據進行線性回歸分析。
根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數（r）的絕對值應該大于或等于0.980，試驗方為有效。否則須重新試驗。
干擾試驗 選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個平行管。
表4 光度測定法干擾試驗的制備
注 A：稀釋倍數未超過MVD的供試品溶液。
B：加入標準曲線中點或靠近中點的一個已知內毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數的供試品溶液。
C：如“標準曲線的可靠性試驗”項下描述的，用于制備標準曲線的標準內毒素溶液。
D：陰性對照。
按所得線性回歸方程分別計算供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。
R=(CS-Ct)/λm×100%
當內毒素的回收率在50%~200%之間，則認為在此該試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。
當內毒素的回收率不在指定的范圍時，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素。并要重復干擾試驗來驗證處理的有效性。
當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。
檢查法
按“光度法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。
使用溶液C生成的標準曲線來計算溶液A的每一平行管的內毒素濃度。
試驗必須符合以下三個條件方為有效：
（1）系列溶液C的結果要符合 “標準曲線的可靠性試驗”中的要求。
（2）用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度后，計算出的內毒素的回收率要在50%-200%的范圍內。
（3）溶液D在規定的時間內不發生反應。
若供試品溶液所在平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數和濃度后，小于規定的內毒素限值，判供試品符合規定。若大于規定的內毒素限值，判供試品不符合規定。
（注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。）
來源--中華人民共和國藥典2005年版 附錄Ⅺ E |
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