|
【摘 要】 采用廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)共同研制的抗葡聚糖多克隆抗體和DEX-OVA交聯(lián)的免疫原，確定了最佳的抗原包被濃度為5ug/ml，最佳的多抗工作濃度為1：8000。建立了競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA定量檢測(cè)葡聚糖的方法；并嘗試了對(duì)原糖樣本的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】 葡聚糖；多克隆抗體；競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA；定量檢測(cè)；原糖
前言
從原理上說，葡聚糖的檢測(cè)方法大體上可分為兩大類：一類是基于葡聚糖發(fā)生化學(xué)變化的原理，即通過化學(xué)反應(yīng)使葡聚糖變成可直接檢測(cè)的其它物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，如Robert銅法是葡聚糖用硫酸水解后變成葡萄糖，再用酚顯色，通過測(cè)定葡萄糖的量來推算葡聚糖的含量[1]；另一類是基于葡聚糖物理性質(zhì)的原理，如Haze法、SPRI法，是利用葡聚糖會(huì)在酒精中沉淀，產(chǎn)生濁度，通過比較濁度的大小而判定葡聚糖的含量。但目前常用的葡聚糖定量檢測(cè)方法都存在預(yù)處理困難、操作復(fù)雜、雜質(zhì)干擾嚴(yán)重影響結(jié)果等缺陷[2]，免疫學(xué)檢測(cè)法是一個(gè)很有希望的方向，具有快速、準(zhǔn)確、樣本預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適合于制糖工藝任一工序中葡聚糖含量的測(cè)定。
本文采用廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院共同研制的葡聚糖多克隆抗體[3]，初步建立了葡聚糖的競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA檢測(cè)方法。
1 材料與方法
1.1 主要儀器及試驗(yàn)材料
BIO-RAD 680酶標(biāo)儀；Dextran 40、2000為Pharmacia公司產(chǎn)品；抗葡聚糖陽性抗體為StemCell產(chǎn)品，其它試劑為國產(chǎn)試劑；葡聚糖多克隆抗體為廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院共同研制。
1.2 葡聚糖競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法的建立
1.2.1 方陣法確定抗原包被濃度和抗體的工作濃度[4]
將Dextran T40-OVA交聯(lián)物按2.5、5、10、20μg/mL橫向包被酶標(biāo)板，每孔100μL（純化的抗體經(jīng)適當(dāng)稀釋后與梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液各50μL），37℃，過夜。用封閉液（10%正常人血清）封閉2h；每孔加入不同稀釋度的多抗100ul（1：1000……1：128000），同時(shí)設(shè)立陽性、陰性對(duì)照，37℃放置1h；用PBST洗滌液洗3次后,加羊抗兔酶標(biāo)二抗，37℃放置1h；再用PBST洗3次，加入OPD底物溶液，37℃避光放置15min；加終止液（2M H2SO4溶液）終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀取OD490結(jié)果，根據(jù)OD490值及具體情況確定包被濃度和抗體的工作濃度。
1.2.2 葡聚糖競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法的建立[5]
應(yīng)用葡聚糖多克隆抗體，建立葡聚糖抑制競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。以Dextran 40-OVA交聯(lián)物最佳包被濃度5ug/ml包被96孔板，設(shè)陽性、陰性對(duì)照。抗體為確立的最佳稀釋度（1：8000），標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制物為梯度稀釋的葡聚糖，進(jìn)行板內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1h，其他步驟同上述間接ELISA方法[3]。根據(jù)酶標(biāo)儀讀取OD490的數(shù)值，計(jì)算抑制率，以抑制率（A標(biāo)/A0×%）為縱坐標(biāo)，以抑制濃度為橫坐標(biāo)，繪制葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.3 葡聚糖競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法[6]檢測(cè)原糖樣本
以Dextran 40-OVA交聯(lián)物最佳包被濃度5ug/ml包被96孔板，設(shè)陽性、陰性對(duì)照。抗體為確立的最佳稀釋度（1：8000），為消除蔗糖在過程中的影響，用與原糖濃度相同的蔗糖溶液和梯度稀釋的葡聚糖混合液作為標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制物，進(jìn)行板內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1h，其他步驟同上述間接ELISA方法。根據(jù)酶標(biāo)儀讀取OD490的數(shù)值，計(jì)算抑制率，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
同時(shí)以Dextran 40-OVA交聯(lián)物最佳包被濃度5ug/ml包被96孔板，設(shè)陽性、陰性對(duì)照。抗體為確立的最佳稀釋度（1：8000），用原糖樣本作為競(jìng)爭(zhēng)抑制物，進(jìn)行板內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1h，其他步驟同上述間接ELISA方法。根據(jù)酶標(biāo)儀讀取OD490的數(shù)值，計(jì)算抑制率，和標(biāo)準(zhǔn)曲線中的抑制率比較，可得到原糖中葡聚糖的含量值。
2 結(jié)果與分析
2.1 最佳包被濃度與抗體稀釋度的確立
ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。根據(jù)表中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在其它因素相同的情況下，在包被濃度5ug/ml，稀釋度為1：8000時(shí)，OD490值為1.365。
表1 Dextran 40-OVA包被濃度與抗體稀釋度的篩選
|
Dextran 40-OVA (ug/ml)
|
多抗稀釋度
|
|
1/1000
|
1/2000
|
1/4000
|
1/8000
|
1/16000
|
1/32000
|
1/64000
|
1/128000
|
|
2.5
|
1.329
|
0.935
|
0.441
|
0.204
|
0.145
|
0.082
|
0.062
|
0.038
|
|
5
|
2.922
|
2.53
|
2.019
|
1.365
|
0.908
|
0.617
|
0.368
|
0.195
|
|
10
|
1.74
|
1.506
|
0.651
|
0.26
|
0.16
|
0.098
|
0.071
|
0.047
|
|
20
|
1.767
|
1.274
|
0.563
|
0.223
|
0.105
|
0.08
|
0.053
|
0.019
|
|
0
|
0.007
|
0.005
|
0.005
|
0.006
|
0.007
|
0.007
|
0.006
|
0.006
|
根據(jù)OD值應(yīng)在1.0～1.5之間，且包被抗原及單抗用量少的原則，我們選擇包被濃度為5ug/ml，抗體的稀釋度為1：8000。
2.2 葡聚糖競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖抑制濃度按1024ug/ml倍比稀釋，用已經(jīng)建立的ELISA方法做間接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)葡聚糖濃度大于512ug/ml時(shí)，反應(yīng)完全被抑制；當(dāng)葡聚糖濃度小于0.06ug/ml時(shí)，反應(yīng)幾乎不被抑制。
以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率（A標(biāo)/A0×100）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取線性關(guān)系良好的范圍作曲線，見圖1。數(shù)據(jù)用EXCEL分析，曲線擬合方程為y=-5.9409x+94.618，相關(guān)系數(shù)R2=0.9951。
圖1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.3 原糖樣本中葡聚糖含量的檢測(cè)
2.3.1 檢測(cè)原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
為消除蔗糖對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制物為蔗糖和葡聚糖混合液，其中蔗糖濃度為100mg/mL保持不變，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度1mg/mL起倍比稀釋，結(jié)果見圖2。
圖2 檢測(cè)原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.3.2 原糖樣本檢測(cè)
原糖樣本濃度為100mg/mL，抑制率為26.29%，從圖中可知此時(shí)葡聚糖濃度約為40。即原糖中葡聚糖含量為400×10-6。
3 討論
本研究采用廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)共同研制的抗葡聚糖多克隆抗體和DEX-OVA交聯(lián)的免疫原，確定了最佳的抗原包被濃度為5ug/ml，最佳的多抗工作濃度為1：8000。
以純化的抗葡聚糖多克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立了競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA定量檢測(cè)葡聚糖的方法；從試驗(yàn)結(jié)果說明此方法葡聚糖的檢出限為0.06×10-6至512×10-6。
該抗葡聚糖多克隆抗體具有特異性強(qiáng)，效價(jià)高的特點(diǎn)，建立的競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA定量檢測(cè)葡聚糖的方法具有簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
嘗試了對(duì)原糖樣本的實(shí)際檢測(cè)，該原糖樣本用《原糖》國標(biāo)的酒精沉淀法測(cè)定，結(jié)果葡聚糖含量為483×10-6。由于酒精沉淀法測(cè)定的是總多糖的量，結(jié)果可能偏高，免疫法測(cè)定的結(jié)果比國標(biāo)法測(cè)定結(jié)果稍低，是可以接受的。
參考文獻(xiàn)
[1]陳其斌,周重吉.甘蔗制糖手冊(cè)（第十二版）[M].華南理工大學(xué)出版社,1993.
[2]Christine F. Brown，Peter A.Inkerman. Specific Method for Quantitative Measurement of the Total Dextran Content of Raw Sugar,J.Agric.Food Chem.1992,40,227-233.
[3]曾練強(qiáng),王生育,李雨虹等.葡聚糖多克隆抗體制備與純化[M].廣西輕工業(yè),2009,(11）:4-5.
[4]JEROEN DOUWES, GERT DOEKES,ROY MONTIJN，et al. Measurement of b(133)-Glucans in Occupational and Home Environments with an Inhibition Enzyme Immunoassay，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Sept.1996,p.3176–3182.
[5]聞平,郭月芳.(1，3)一D一葡聚糖ELISA檢測(cè)方法建立及初步臨床應(yīng)用[M].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2003,l8(5):1-2.
[6]陳蘭明,陳永董.黃曲霉毒素B1直接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA快速篩選法的建立[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998.21(4):62-65.
[作者簡(jiǎn)介]曾練強(qiáng)，男，高級(jí)工程師，從事化學(xué)、微生物學(xué)等方面的研究工作。
|
