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輪狀病毒（rotavirus，RV）純化方法，僅供參考 方法一 氯化銫密度梯度離心純化法（用密度梯度來做，首先我們需要什么樣的轉頭，角式的，或者是甩平轉頭，一般用甩平轉頭。在準備密度梯度時，對病毒的浮力密度要清楚是多少，具體數字，然后我們才能知道用多大濃度的梯度介質。） 1、病毒濃縮 （1）PEG沉淀病毒：在收集到的病毒上清加入終濃度5％的PEG6000, 4℃攪拌過夜，10,000rpm, 4℃, 1.5小時離心，棄上清，用TNMC緩沖液(50mM Tris-Hcl pH7.5, 100mM Nacl, 10mM Cacl2,1mM Mgcl2 )懸浮沉淀； （2）三氟三氯乙烷抽提：取PEG濃縮的病毒液，加入等體積的三氟三氯乙烷（三氟三氯乙烷是有機溶劑，可以去除許多細胞中的雜質（如脂類），同時因為rotavirus沒有包膜，所以能抵抗三氟三氯乙烷。）抽提一次，12,000rpm, 4℃，10min，離心，收集水相,TNMC緩沖液10倍稀釋后，50,000rpm, 4℃, 1小時離心，沉淀用TNMC緩沖液懸浮。 2、CsCl密度梯度離心 取病毒液，與CsCl制成56％的乳化液，裝入5ml梯度離心管中，水平轉頭50,000rpm, 4℃, 22小時超速離心。得三條乳白色的條帶。分別收集離心所得的條帶，用TNMC緩沖液稀釋10－15倍，50,000rpm, 4℃, 1.5小時，離心去除CsCl，得到分離后較純的病毒。 方法二 蔗糖密度梯度離心： 1、配制60%、45%、30%、15%的蔗糖（蔗糖M/水V），還有60%、50%、40%、30%、15%的蔗糖溶液也可以。加熱溶解之后，0.22UM濾器過濾，4度保存備用，注意：一定要配的準確。 2、蔗糖密度梯度離心管，大和小兩種。 3、小管離心管，每種蔗糖溶液加2~2.5ml，依據你的病毒液體有多少。先加密度小的蔗糖溶液，在加密度大的，依次類推，加的時候要溫柔呵呵！用于加蔗糖梯度的注射器用干凈\高壓的玻璃注射器(2.5ML), 一次性塑料注射器密封性不好和注射器芯容易變形, 加蔗糖和樣品不準，針頭是比較長的,至少有10CM長,具體打電話問下試劑公司. 4、加蔗糖溶液有專門的針頭，比蔗糖離心管長。 5、要做這個試驗的時候，提前把離心管洗干凈。 方法三 Preparation of Virions Containing Uncleaved VP4 1、Infect MA104 cells at a high MOI(3–10PFU/cell)with trypsin-activated virus. 2、Wash the cell sheet several times with serum-free medium following adsorption. 3、Maintain the cells in trypsin-free medium containing 1μg/mL aprotinin or 0.5μg/mL leupeptin. 4、Harvest the cells once the CPE has reached 70–80% (24 h post infection). Purification of Triple-Layered Virions 1、Combine the lysate with an equal volume of trichlorotrifluoroethane, and homogenize the mixture with a Sorvall Omni-mixer for three 1min cycles on ice. 2、Centrifuge the homogenates at low speed to separate the organic and aqueous phases (4100g for 10 min in a Sorvall GSA rotor at 4°C). 3、Pellet the virus particles from the aqueous phase by centrifugation at 90,000g in a Beckman (Palo Alto, CA) SW28 rotor or at 45,000g in a Beckman Type 19 rotor for 2h at 4°C. 4、Resuspend the pellet in TBS, and add CsCl to the virus suspension to achieve a density of 1.370g/cm3, as determined by refractometry (see Note 7). 5、Centrifuge the mixture at 110,000g in a Beckman SW50.1 rotor for 20h at 4°C. 6、Inspect the gradients in a darkened room with an inverted light source, to reveal two bands. 7、Recover the virus from the gradient by puncturing the bottom of the centrifuge tube with a 21-gage needle, and collect drops containing TLPs and DLPs, respectively,into separate tubes. 8、Remove the CsCl by dialyzing the virus extensively against TBS at 4°C. 9、Store the dialyzed samples at 4°C in the presence of 0.01% NaN3. Tris-buffered saline(TBS): 8g NaCl, 0.38g KCl, 0.1g Na2HPO4, 1g dextrose,3g Tris-base, 0.1g MgCl2, 0.1g CaCl2. Dissolve in distilled H2O, adjust to pH 7.4 with HCl, and make up to 1L. 用完整的病毒作為抗原，做ELISA試劑的最低層，不需要純化病毒。只需包被RV作檢測抗體之用，這是間接法ELISA。細胞培養的病毒用包被緩沖液做1:40稀釋（病變出的好，這個稀釋度就跑不了，我們實驗室做了若干年了），每孔100ul,過夜成了。如果不放心，可以高速離心后再過G200柱，這個方法比超離方便多了。病毒從凝膠空隙最早流出，而雜蛋白進入孔內出來的緩慢。ELISA不需要太純的病毒。不知道是SA11還是Wa株？前者病變非常典型，后者病變緩慢，如果不放心1：40稀釋，可以用有限稀釋方法滴定抗原用量。 |
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