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經典型的苯丙酮尿(Phenyketon uria簡PKU)是由苯丙氨酸羥化酶(PAH)的遺傳性 缺陷引起的一種先天性代謝病，其發病早在我國以為1/10000左右，雜合子頻率為 1/50. PKU的臨床表現 PKU患兒由于苯丙氨酸羥化酶的缺乏或不是使苯丙氨酸在休丙大量堆識，并經旁 路代謝途徑產生一系列的毒性代謝產物而該小兒產生一系列的明顯中毒癥狀.患兒在 剛出生時，由于無苯丙氨酸的攝入因此無臨表現.隨著患兒的退食而連續出現智力進 行性下降，皮膚色素淺，肌張力高，驚厥發生，汗和尿中有特殊的臭味，最經生活不 能自理，智力嚴重障礙. PKU的遺傳學 PKU是一種常染色體隱性遺傳病，患兒的父母為致病基因的攜帶者而患兒為純合 子.引起PKU的基因的PAH，該基因位于12q22-24.2全長約90kb，包括13個外顯子和12 個內含子.內切酶解分析顯示PAH的完整cDNA其有8個限制性內切酶切點，形成10個 RFLP.在人群中這些RFLP可組成1536種單倍型.過去對PKU的診斷即用此連鎖分析.另外 在PAH基因內含有數個VNTR和STR.外顯子3'鎖700bp處有-(TCTA)重復序列，外顯子 133'端下游3kb內有-30bpVNTR，它們仍有食雜的遺傳病多態現象，可用為連鎖分析時 的標記. PAH基因突變類型 PAH基因的突變常見的有兩種類型即缺失和單堿基置換，在我國人群中，已檢測的 PKU均因PAH基因的單堿基量換所致.目前在我國其檢出了15種以上的點突變6見表，這 些點突變在我國南方和北方人群中的頻率有的不同.因此在PKU的診斷中注意這種差別. 中國人已檢出的PAH基因點突變
PAH基因點突變的PCR檢測 (一)PCR-ASO斑點雜交 在我國人群中，目前所發現的PAH基因突變以點突變為主，因此可以此來合成相 應的突變型寡核苷酸探針.來檢測PKU患者的點突變，ASO法是最為有效的點突變檢測 技術.隨著非同位素標記探針的出現及反向斑點雜交的應用，預記該方法的臨床應用 將愈來愈廣泛.下表訓列即為利用PCR-ASO檢測時所用的引物. 探針
擴增時所用引物系根據每個外顯子兩側的旁側序列的設計.擴增片段包括完整的 外顯子區域其兩側部分內含子序列. (二)3'-堿基特異PCR，高位特異PCR 在以PCR為主的已知突變檢測中，3'BSPCR是最簡便可行的一種檢測技術.在應用 時，采用正常引物和突變引物兩組試驗，以確定何種引物可擴增，然后電泳確定有無相應的突變. 由個PAH各外顯子間的距離較大，各自有獨立的引物，因此可用多重PCR同時擴增數 個外顯子.不應同時，可將正常引物編為一組，突變引物編為一組進行兩組多滲PCR. 然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物以確定突變位點. 表所到即為國內報道的用等位特異PCR 診斷PKU后用的相物及擴增片段，檢測位置
(三)用PCR直接檢測發生點突變的內切酶點 在PKU已檢出的突變位點中，有七個位點的突變改變了限制性內切酶的識別位點. 若用該酶切位點兩側的引物擴增包括內切酶識別位點在內的DNA的酶，然后將擴增產物用內切酶 溶解，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切點段，以判定個體有無該內切酶識別位點的突變，引起內切酶識別 位點改變的點突變見
(四)新的突變位點的PCR篩查: 對于有患者，不夠用上述的PCR方法檢出其突變位點，則可用PCR-SSCP，PGGE、 CDGE及其它的突變位點篩查技術進行篩查，以確定檢出的突彎位點與PKU的關系. PKUPCR診斷的途徑 (一)利用PCR-ASO檢測，近年來又發展了反向點雜交及非同位標記探針，與PCR-A SO應用起來更為方便，它是檢測PKU點突變的最為手段之一. (二)利用等位特異PCR(ASPCR) 若將ASP-PCR與多重PCR結合，形成MASP-PCR則一見可檢測多個突變位點，要是一 個非常有效的PKU診斷手段. (三)利用PCR-RFLP診斷 由于某些突變涉及到酶切位點的變化，因此右PCR-RFLP進行診斷PKU. PCR在PKU的產前診斷斷中的應用 由于PKU的治目前沿無有效的方法，因此其產前診斷，防止PKU患兒的出生具有重 要的意義，在PKU的產前診斷中，RFLP是較為傳統的診斷方法，操作費時，不能及時 提供臨床診斷信息，而且有相當大的一部分不能提供信息加止還要用同位素標記的探 針進行操作，因而大大的限制了其原因，應用PCR技術診斷PKU快速準確，易于滿足臨 床需要，而是便于推廣應用. (一)，PCR-ASO 傳統的PCR-ASO及類似的診斷方法盡管準確有效，但操作復雜，往往需要進行多 次操作，確診一測頗為費時，近年來應用的反向點雜交法(reverse dot bolt RDD)， 改變了傳統的點雜交程序，因而該其檢測時程明顯縮短，操作也較簡化.RDB是將一系 列的ASO探針先固定于膜上，然后用擴增的靶DNA與之雜交，在應用時，可將一些較為 常見的點突變探針固定于同一膜，而少見的固定于同一膜，因此結束分析樣品最多只 需雜產兩次即可完成PKU的診斷，在這種情況下，即使無證者一亦可進行產前診斷. (二)MASP.PCR 采用MASPPCR亦是進行已知PAU突變點基因產前診斷的簡易方法之一. (三)AmPFLP+PCR-SSCP快速診斷 盡管采用PCR-ASO和MASP-PCR可檢測全部的常見的PAH基因的已知點突變，但它只 能診斷約70～80%的PKU患者及浸入，仍有相當一部分不能同上述方法進行產前診斷， 我國董尚志等人利用PAH是國內的STP及VNTR作為多態性標記結合PCR-SSCP進行產前診 斷，其診斷的準確率可達90%左右診方法包括以下幾步. 1.Amp-FLP連鎖分布：等用PAH基因內含子中-STR多態性進行分析，可次66.2%的家之獲得有用的診斷信 息，其引物序列為:可擴增片段大小范圍為，擴增完畢合用變性膠(尿素)PAG電泳分析 擴增長產物的片段多態性和先證者及攜帶者對照，確定胎兒的基因組合，以判斷是否 為PKU患兒，若用連鎖分析不能診斷則進入下步 2.外顯子4PCR-SSCP 3.外顯子7，11，12SSCP分析：通過上述3步分析，診斷常可達90%以上，該方法簡使快速，準確率多，極適合于 基礎應用.若將PCR-ASORDB與Amp-FLP聯合應用，則定確率定高，況且要進行雜交，條 件及探治相對復雜，因此尚不夠廣泛推廣于臨床檢測. |
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