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地中海貧血是由組成珠蛋白的X珠蛋白鏈和B珠蛋白鏈基因突變的引起，它包括X 地中海貧血和B地中海貧血，世界疾病在我國(guó)南方各省區(qū)的發(fā)病率相當(dāng)高，個(gè)別地區(qū) 可達(dá)18%，它的嚴(yán)重的影響人口的質(zhì)量. 一、地中海貧血的臨床 (一)X地中海貧血的臨床:X地中海貧血在臨床上可分為四 種類型①HbBarst胎兒水腫綜合征②HbH病③輕型(標(biāo)記型)X地中貧血及④靜止型地中 海貧血.(二)B地貧在臨床上亦分為四型①重型B地中海貧血，②輕型B地中海貧血③中 間型地中海貧血及④遺傳性胎兒Hb持續(xù)存在癥.其中第④類型較為常見. 二、地中海貧血的遺傳學(xué) (一)α地中海貧血:α地中海貧血的發(fā)生是由于α珠蛋 白鏈基因突變的結(jié)果，α珠蛋白是基因定位于16P16-4er)，每條染色體上均有兩個(gè)α 珠蛋白基因，該基因其長(zhǎng)30Kb其中包括有兩個(gè)假基因和一個(gè)胚胎性Hb鏈基因，每個(gè)α 基因含有兩個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子總長(zhǎng)約0.5Kb.(二)β地中海貧血:β地中海貧血由β 珠蛋白鏈基因突變所引起，該基因定位于11P15.5，總長(zhǎng)度約70Kb，其中有許多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有兩個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，總長(zhǎng)約為1.126Kb. 三、α和β珠蛋白基因的突變類型 (一)α-基因的突變:在α-基因的突變中，以 缺失型突變最為常見，其缺失的范圍可從兩個(gè)α-基因均缺失至一些小片段的缺失均 可在人群中檢出，α-基因的另一突變即為單堿基置換，目前已發(fā)現(xiàn)的突變有18種以 上，它包括錯(cuò)義突變，無意突變剪接部位突變及起始信號(hào)突變.(二)β-基因的突變: β-基因的突變以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎磫魏塑账嶂脫Q是β-基因的主要突變類型，它亦有堿基的括入和缺失，在我國(guó)檢出的β-基因點(diǎn)突變見下表:
四、PCR技術(shù)在α地貧基因診斷中的應(yīng)用 α地貧是由α珠蛋白基因不同范圍的缺 失及點(diǎn)突變所致，但以缺失型突變最為常見，因此，α地貧PCR診斷的主要任務(wù)就在于快速檢出α珠蛋白基因的缺失片段. (一)α基因全部缺失(--1--)的PCR診斷 α基因全部缺失所引起的臨床表現(xiàn)為HbBar+胎兒水腫綜合征，用PCR方法檢測(cè)等，其反應(yīng)體系組成如下: 引物: PC01；5'TACTGTAGATACCCGTGTACAA3' PC02；5'ATCARGGAAACATAGTAAT3' PC03；5'ACACAACTGTGTTACCTAGC3' PC04；5'CAACTTCATCCACGTTCACC3' 擴(kuò)增片段：αPC01-PC02；136；- βPC03-PC04；110；110 擴(kuò)增條件：93℃(30'')；45℃(30'')；65℃ 檢測(cè)：3%珠脂糖電泳 注):PCO3和PCO4擴(kuò)增片段位于β基因，作為內(nèi)對(duì)照. 結(jié)果判定:在正常人PCO1-PCO2擴(kuò)增片段為B6bp，PCO3-PCO4為110bp，而HbBart胎兒水腫綜合征僅有PC)3-PCO4的110擴(kuò)增片段而無PCO1和PCO2的136bp擴(kuò)增產(chǎn)物. (二)部分α基因缺失型的PCR檢測(cè) 除HbBart胎兒水腫外，在α地貧中，尚有部分α基因缺失的類型，它仍是α地貧2，α地貧HbH病，應(yīng)用PCO1和PCO2時(shí)正常和缺失染色體均有擴(kuò)增，因此對(duì)2，2，HbH及正常個(gè)體不能鑒別，因此又有人設(shè)計(jì)了一組新的引物體系進(jìn)行α基因缺失的檢測(cè)，該本系的組成及操作過程如下
五、PCR技術(shù)在β地貧基因診斷中的應(yīng)用 β地貧的基因突變主要是單堿置換.目前在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單堿基置換達(dá)160余種，其中在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的有21種，由于β珠蛋白基因的突變主要為單堿基堿置換，因此其診斷途徑與β地貧完全不同，其診斷的主要目的即檢出點(diǎn)突變. (一)檢測(cè)已知突變位點(diǎn) 1.PCR-ASD與ROB PCR-ASO是快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)已知β珠蛋白基因點(diǎn)突變的方法，主是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段，然后用人工合成的含突變位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針，逐一篩查，泛檢測(cè)的反應(yīng)體系包括. 引物:見下表
點(diǎn)膜與雜交:PCR-ASO是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)于雜交膜上，然后與上述的ASO探針雜交，根據(jù)雜交的結(jié)果判斷分析，以確定突變位點(diǎn)RDB以改傳統(tǒng)的雜交途徑，它是將一系列的標(biāo)記ASO探針固定在膜上，然后用之與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，使檢測(cè)程序大大簡(jiǎn)化. 張是增等人根據(jù)我國(guó)常見的β基因突變情況，將18種5突變分為兩組，一組為常見的，另一組為非常見，與這些突變相對(duì)應(yīng)的ASO探針反分為兩組，將這些探針固定于膜上，再與相反的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，常用的7種ASO探針可檢出98%的中國(guó)人β基因點(diǎn)突變同RDB方法簡(jiǎn)便，快速，使用非同項(xiàng)素標(biāo)記的ASO探針使之節(jié)約于推廣，而是探針膜條便于保存和運(yùn)選. 2.等位特異PCR(ASAPCR) ASAPCR是檢測(cè)已知β基因突變優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行β地貧基因診斷又一有效手段，有人用該方法檢測(cè)Cordows41-42，TVSnt654，CD17TATA盒-28和CD71-72，這五種我國(guó)南方常見的β基因點(diǎn)突變?cè)\斷β地貧，完成的用于產(chǎn)前診斷. 3.PCR-RFLP檢測(cè)引起內(nèi)切酶切點(diǎn)改變的突變?cè)\斷β地貧.
(二)突變性質(zhì)不明β地貧的診斷 在β地貧中，尚有一部分人群的基因突變性質(zhì)不明，但臨床表現(xiàn)為β地貧則可用PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGG進(jìn)行突變片段篩查，然后對(duì)異常的片段進(jìn)行快速測(cè)定，以確定突變位置性質(zhì)及β地貧的關(guān)系.
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