陳文學(xué) 鄒學(xué)森 陳岳青 黃秀珍 鐘禮瀑
（江西省腫瘤醫(yī)院 腫瘤研究所， 江西 南昌 330029）
[摘要] 熒光定量PCR技術(shù)具有簡便、靈敏、準確等優(yōu)點，目前已經(jīng)在乙肝和性病的診斷和治療中得到了廣泛的應(yīng)用，但在腫瘤方面的應(yīng)用還處在研究和開發(fā)階段。本文綜述近年國內(nèi)外相關(guān)熒光定量PCR技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用。
[關(guān)鍵詞] FQ-PCR；腫瘤；人乳頭瘤病毒；EB病毒
腫瘤是危害人類健康的一種疾病，它的惡性程度與預(yù)后判斷主要依靠是否有轉(zhuǎn)移和病理切片分期。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，腫瘤研究領(lǐng)域的大量研究成果顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后與腫瘤細胞內(nèi)部基因和腫瘤相關(guān)病毒有關(guān)。本文綜述了熒光定量PCR技術(shù)的原理及其在腫瘤研究中的應(yīng)用。
1.單管熒光定量PCR技術(shù)的原理
單管熒光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR）的反應(yīng)體系中除了普通PCR所需的引物外，還有一條熒光探針，探針的5`端標記了熒光報告基團，3`端標記了熒光淬滅基團，當(dāng)這條探針保持完整時，熒光淬滅基團抑制熒光報告基團發(fā)出熒光。PCR反應(yīng)開始后，隨著DNA鏈的延伸，Taq酶的5`-3`外切酶活性將熒光探針切斷，熒光淬滅基團的作用消失，熒光報告基團就發(fā)出了熒光信號，熒光信號的強弱與PCR的產(chǎn)物數(shù)量成正比，根據(jù)測量到的熒光信號強弱，通過分析軟件得到樣本的原始拷貝數(shù)。
2. FQ—PCR的優(yōu)點
FQ—PCR技術(shù)是融合了PCR技術(shù)與DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點，實驗的整個過程只在加樣時打開1次反應(yīng)管，在PCR的每個循環(huán)中可以直接監(jiān)測到熒光信號的變化，根據(jù)PCR反應(yīng)酶動力學(xué)特點分析軟件會自動對DNA進行定量，因此也有人稱FQ-PCR為實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR）。其優(yōu)點為：①FQ-PCR解決了傳統(tǒng)PCR技術(shù)不能定量和擴增產(chǎn)物污染的問題。②避免了普通定量PCR操作過程中的污染，F(xiàn)Q-PCR只在加樣時打開反應(yīng)管1次。③FQ-PCR操作簡便、快捷、結(jié)果準確，不需要普通PCR擴增后進行電泳或放射自顯影觀察結(jié)果，方便了臨床上應(yīng)用。④FQ-PCR可以對每一批擴增樣本進行擴增效率的評價。對DNA做系列稀釋，每個稀釋濃度的DNA對數(shù)值與其Ct值做回歸分析，PCR的擴增效率的計算方法為：效率=10-1/斜率。通過計算擴增效率可以對儀器、操作人員和試劑進行綜合評定。
3. FQ-PCR在血液系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用
Jones CD（1）對FQ-PCR技術(shù)預(yù)測慢性髓性白血病（CML）病人的髓外增的有效性進行了評價。FQ-PCR方法檢測372例臨床標本和50例外周血標本p210和 p190 bcr-abl RNA 融合基因的轉(zhuǎn)錄水平，用看家基因?qū)Y(jié)果進行標準化，檢測結(jié)果為特異性100%。敏感性研究顯示，細胞系稀釋到0.0001%時仍然可以檢測到bcr-abl，重復(fù)性實驗顯示組間變異系數(shù)（CV）為12.3%，組內(nèi)變異系數(shù)為13.8。實驗結(jié)果顯示FQ-PCR是一種非常可靠的監(jiān)測bcr/abl陽性CML病人的方法。
熒光原位雜交（FISH）的結(jié)果顯示10%-15%的CML病人bcr-abl雜合子缺失，這樣的病人預(yù)后非常差。FQ-PCR方法可以鑒定CML病人雜合子亞單位上的微小缺失，這種微小的缺失難于用FISH方法分辨出來。Kolomietz（2）用FQ-PCR方法對25例預(yù)后差的病人進行檢測，18例無微小缺失CML病人獲相對較好的治療效果。
Hughes等（3）將1106例CML病人隨機分為imatinib(蛋白激酶抑制劑)治療組和INF-a+卡鉑治療組，用FQ-PCR檢測2個治療組病人血液中bcr-abl的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示imatinib治療組12個月后bcr-abl的轉(zhuǎn)錄水平降低了3個數(shù)量級，治療效果明顯優(yōu)于INF-a+卡鉑治療組。CML病人bcr/abl的轉(zhuǎn)錄水平降低了3個數(shù)量級或無轉(zhuǎn)錄者，預(yù)后較好。
4. FQ-PCR在乳腺癌中的應(yīng)用
Weigelt等（4）用FQ-PCR方法檢測94例乳腺癌轉(zhuǎn)移的病人外周血CK19、p1B、PS2 和 EGP2的mRNA水平，通過QDA將4個基因綜合成一個評價指標。在77例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的病例中發(fā)現(xiàn)QDA陰性病人的存活率明顯高于QDA陽性病人(P=0.015 、0.0053)，QDA陽性的病人1年存活率為3%，2年的總存活率為17%，而QDA陰性的病人存活率為36%。
ANG1 和ANG2是腫瘤細胞分泌的促進腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的因子，Sfiligoi（5）研究了ANG與腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤病人的生存率之間的關(guān)系。38例乳腺癌活檢標本提取mRNA,用FQ-PCR技術(shù)測定ANG1 和ANG2基因水平，檢測結(jié)果與臨床病理和臨床生化指標相比較，發(fā)現(xiàn)ANG2與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有高度的相關(guān)性，單變量和多變量生存分析顯示，ANG2 mRNA 水平與疾病（p < 0.0001）、總存活率(p < 0.0003)呈單因素高度相關(guān)性。
5. FQ-PCR在胃腸道腫瘤中的應(yīng)用
胃癌手術(shù)后的腹膜播散是胃癌復(fù)發(fā)的常見原因。Ueno（6）對124例胃癌手術(shù)病人實施腹腔灌洗，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)檢測灌洗液中CEA水平，結(jié)果顯示CEA的Ct值與腫瘤的侵犯深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、血管轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、存活率有高度的相關(guān)性。CEA的Ct值預(yù)測腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移的敏感性為76.9%，特異性為67.7%，而細胞學(xué)檢測的敏感性只有23.1%。這些實驗數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)檢測灌洗液中CEA水平，對預(yù)后和診斷是否有腹膜轉(zhuǎn)移是一個很好的指標。
alpha4GnT是一種糖苷轉(zhuǎn)移酶，它只存在于胃癌細胞中，外周血中檢測不到。Shimizu（7）對37例胃癌病人和23名健康人外周血alpha4GnT的mRNA進行熒光定量檢測，胃癌病人的檢出率為62.2%，而健康人未檢測出陽性。令人振奮的是有5例早期胃癌病人，胃癌侵犯只局限在粘膜層，alpha4GnT的mRNA的檢出率達到80%。慢性胃炎、胃幽門螺桿菌感染的良性病變的alpha4GnT mRNA水平明顯低于胃癌病人。這些結(jié)果表明定量檢測外周血中alpha4GnT的mRNA是對胃癌的一個很好的檢測指標。
肝癌的早期發(fā)現(xiàn)對肝癌的治療和預(yù)后非常重要，Chuma（8）對7個早期肝癌結(jié)節(jié)和7個進展期肝癌結(jié)節(jié)的12 600個基因進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)95個基因可以區(qū)分早期肝癌和正常組織，92個基因可以區(qū)分早期肝癌和進展期肝癌，其中熱休克蛋白70基因（HSP70）在早期肝癌結(jié)節(jié)中明顯上調(diào)，與癌前病變組織、正常組織存在明顯差異（p<0.001）。
6. FQ-PCR在其它腫瘤中的應(yīng)用
Gelmini（9）用FQ-PCR方法檢測43例前列腺癌和16例前列腺良性增生病人的活檢組織PSA，前列腺癌病人的PSA mRNA水平變異非常大，平均2.5 x 107（ 2 x 104 - 2.1 x 108 ）/ml，而良性增生腫瘤組織的平均拷貝數(shù)為1.3 x 106/ml,前者的表達水平明顯高于后者(p = 0.006)，但是前列腺癌組織的PSA mRNA水平與外周血中PSA mRNA水平無相關(guān)性。Straub（10）用高靈敏度的FQ-PCR方法檢測了129例前列腺癌根治術(shù)前后和19例前列腺良性增生的血標本中PSA mRNA水平，發(fā)現(xiàn)血漿中的PSA mRNA水平可以反映外周血中前列腺癌細胞的數(shù)量，對病人早期治療和手術(shù)后病情監(jiān)測及預(yù)后有一定幫助。
Survivin 是一種凋亡抑制蛋白，在非小細胞肺癌（NSCLC）早期呈現(xiàn)過度表達。Falleni[11]對86例NSCLC病人（IA and IB）定量檢測Survivin mRNA水平，結(jié)果80例（96%）病人檢測出Survivin mRNA表達，明顯高于正常肺組織 (p = 0.008)，并且鱗狀細胞癌的表達水平高于其它類型腫瘤(p = 0.0022)，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)是對肺癌早期診斷的一種有效手段。
最近又有文獻報道將FQ-PCR技術(shù)應(yīng)用到頭頸腫瘤（12）、口腔腫瘤（13）、淋巴瘤[14]等腫瘤中，得到了較好的檢測結(jié)果。
7. 腫瘤相關(guān)病毒的檢測
人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌的主要誘發(fā)因素，已經(jīng)證實宮頸癌組織與正常組織的HPV早期基因（E7）的表達水平有顯著差異，Lamarcq等（15）用FQ-PCR方法探討宮頸脫落細胞E7基因的轉(zhuǎn)錄水平是否可以診斷早期宮頸癌，結(jié)果顯示在高分化SIL中HPV16或HPV18的E7基因的檢出率為47%，正常組織未檢測到，兩者存在顯著差異（p<0.006）,此項實驗也證明E7基因可以作為宮頸癌早期篩查的指標。Dong SM等[16]對175例宮頸浸潤癌，57例宮頸原位癌，60例正常對照的血漿進行傳統(tǒng)PCR方法與FQ-PCR方法擴增HPV基因進行比較，傳統(tǒng)方法浸潤性宮頸癌的檢出率為6.9%， 原位癌的檢出率為 1.8%, 正常組織的檢出率為1.7% ，F(xiàn)Q-PCR方法對浸潤性宮頸癌的平均拷貝數(shù)為11163拷貝/ml,原位癌的拷貝數(shù)為8拷貝/ml，正常組織拷貝數(shù)為0，F(xiàn)Q-PCR方法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)PCR方法。
早期鼻咽癌可以通過放射治療進行根治，中晚期鼻咽癌有較高的復(fù)發(fā)率。Dong（17）對170例沒有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌實施統(tǒng)一的放射治療方案，在治療前和治療后6-8周用FQ-PCR方法檢測血漿中EB病毒的含量，治療后EB病毒的含量與鼻咽癌的總存活率有高度相關(guān)性（p<0.001）,對鼻咽癌復(fù)發(fā)的陽性和陰性預(yù)測值分別為87%和83%。鼻咽癌治療后EB病毒的含量可以準確反映治療后腫瘤的殘余水平，與腫瘤病人的存活率有高度相關(guān)性。
8. 腫瘤多藥耐藥基因檢測
腫瘤的多藥耐藥基因的出現(xiàn)使許多腫瘤患者治療失敗，以往用流式細胞儀或者免疫組化的方法檢測p糖蛋白（多藥耐藥蛋白）是否表達，或者用PCR的方法檢測mRNA,這些方法都很難實現(xiàn)標準化的操作和統(tǒng)一判斷標準。FQ-PCR方法可以實現(xiàn)標準化的操作，并且可以直接定量出多藥耐藥基因（MDR）的拷貝數(shù)。Burger等（18）對59例原發(fā)性乳腺癌，以化療為系統(tǒng)治療的病人，進行了BCRP、LRP、MRP1、MRP2和MDR1基因的mRNA定量測定，結(jié)果為對化療中度反應(yīng)的病人5種基因的mRNA水平明顯低于對化療沒有反應(yīng)的病人。其中MDR1基因高表達組的病例分期明顯低于MDR1基因低表達組（p<0.005），而且預(yù)后差。其它4種基因也存在同樣差異，但是沒有明顯的相關(guān)性。Tseng（19）對50對正常與頭頸癌組織的MDR1 mRAN研究中發(fā)現(xiàn)，27例T/N>1的標本中IV、III、II和 I期的MDR1分布為59.3%、22.2%、14.8%和3.7%，MDR1水平與腫瘤標本的分期有高度相關(guān)性 (P<0.01)，F(xiàn)Q-PCR方法對MDR1基因的檢測可以輔助病理分期，指導(dǎo)臨床治療。
9. 結(jié)語
FQ-PCR是在臨床上廣泛應(yīng)用的一種基因定量檢測技術(shù)，它不但能夠準確定量腫瘤相關(guān)基因的表達，還可以對外周血中腫瘤標志物進行準確定量，據(jù)此可以對腫瘤早期診斷與腫瘤分期、分型，以及實現(xiàn)對腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后判斷。因此FQ-PCR技術(shù)在臨床上將有更加廣闊的應(yīng)用前景。
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