|
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。
ELISA基本原理
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
ELISA基本操作步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
在包被溶液中稀釋純化的包被抗體（一般0.5-4μg/ml），將該稀釋后的包被抗體100μl/孔加入到酶標板內(nèi)。
用封板膜將板封好防止蒸發(fā)，在室溫（或4℃）孵育過夜。
吸干每一板孔并加洗液洗滌，重復3次。使用洗瓶、多道移液器、多功能分裝器或洗板幾，每孔加400μl徹底洗滌。規(guī)范的操作要求每步完全移出孔中的液體。最后一步，將板中液體移出并將板子在干凈的紙巾上吸附。
加200-300μl/孔封閉液封板，室溫至少孵育1小時。
重復步驟3，可利用真空泵干燥板子。加入干燥劑并封板，至少在4-8℃可貯存2個月。
每孔加100μl適當稀釋的標準品和標本，輕輕敲打板子1分鐘。貼上封板膜，室溫孵育2小時。
重復步驟3
每孔加100μl經(jīng)過適當稀釋的生物素化的檢測抗體，貼上新的封板膜，室溫孵育2小時
重復步驟3
每孔加100μl經(jīng)過適當稀釋的Avidin-HRP或 Streptavidin-HRP，也可加其它種類預先優(yōu)化物
重復步驟3
每孔加100μl底物溶液，避光，室溫孵育5-30分鐘進行顯色反應
每孔加50μl終止液，輕輕振蕩板子確保充分混勻
結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔
中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)
↓
于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，
37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。
↓
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
ELISA需要的基本試劑：
捕獲抗體
檢測抗體
鏈霉親和素-HRP
標準品
96孔酶標板：選擇具有中等或高吸附力的酶標板，禁止使用培養(yǎng)板
包被溶液：0.1M的PBS或者TBS，PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液
阻斷溶液：含3％BSA的TTBS或PBS，或者含有3-5%血清的PBS
標準品/標本稀釋液：含1％BSA的TTBS或PBS
洗液：含0.02％吐溫20的0.002M咪唑鹽溶液或者PH7.4的PBS溶液
底物溶液：兩組份或者一組份的TMB顯色液
終止液：2N的硫酸或者1％HCl溶液
封板膜
ELISA標本的制備和貯存
檢測可溶性蛋白：根據(jù)產(chǎn)品說明書制備血清、血漿標本，由于有些樣品對溫度敏感極易喪失活性，應盡快分離并分裝（一般300～500ul/管），大多數(shù)標本收集和實驗在同一天應貯存在2～8℃。若無法立即測定，應貯存在-70℃，標本貯存時間一般不宜過長，避免反復凍融。使用前將標本平衡至室溫，融化標本嚴禁使用水浴鍋。凍存后或冷藏時間過長的標本可能會出現(xiàn)沉淀或小凝集塊，應在實驗前離心或過濾（0.45um濾膜）標本，體積少的標本不建議過濾。所有標本的收集要使用無菌管，在無菌/半無菌條件下操作防止污染。
血清：將血液在室溫凝集10～15分鐘，1500g離心20～30分鐘，小心吸取血清。
血漿：按試劑盒中的說明書選擇抗凝劑。收集血液時，輕輕搖動試管使抗凝劑與血液充分混合。將血液在室溫保存10～15分鐘，1500g離心15～20分鐘，小心吸上層血漿。
尿液：將尿液收集在無菌的容器內(nèi)。1500g離心10～15分鐘或過濾（0.45um濾膜）去除雜質(zhì)。注意：對于尿液標本實驗的回歸系數(shù)可能發(fā)生變化。
細胞培養(yǎng)上清液：1500g離心10～15分鐘去除細胞和細胞殘渣。若使用常規(guī)典型的培養(yǎng)基，應制備兩條標準曲線，一條使用標準品稀釋液/或?qū)嶒灳彌_液配制標準品，另一條以細胞培養(yǎng)基配制標準品。若兩條標準曲線的變化范圍在10%內(nèi)，實驗結(jié)果可用任一曲線分析。
檢測細胞相關和細胞內(nèi)蛋白：細胞相關蛋白和其它細胞內(nèi)蛋白在ELISA實驗前需要對標本進行處理將目的蛋白釋放出來。
|
