對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行改造,使其在保持快速生長的同時向成骨細(xì)胞方向分化是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),成熟的成骨細(xì)胞可以通過細(xì)胞間的直接接觸作用促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖[ 1 ] ,此外成骨細(xì)胞可產(chǎn)生多種生長因子促進(jìn)其骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化[ 2 ] 。由于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞通過誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化后,難以再與原有的成骨細(xì)胞區(qū)分開,因此,本實(shí)驗(yàn)將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與成骨細(xì)胞以1∶1 的比例直接混合培養(yǎng),同時將成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在與混合培養(yǎng)細(xì)胞完全相同的條件下單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)并取其平均值作為對照,以細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP) 染色陽性率、細(xì)胞培養(yǎng)液上清中堿性磷酸酶含量、細(xì)胞形成鈣結(jié)節(jié)數(shù)目為觀察指標(biāo),將混合培養(yǎng)細(xì)胞與相應(yīng)成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞指標(biāo)的平均值進(jìn)行比較,觀察兩者的區(qū)別。
1 材料與方法
1 .1 材料
無酚紅DMEM 培養(yǎng)液(Hyclon 公司)、胎牛血清(杭州四季清公司)、淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)、堿性磷酸酶染色液及測試盒(南京建成生物工程研究所)。
1 .2 方法
1 .2 .1 成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
1 .2 .1 .1 成骨細(xì)胞分離、培養(yǎng) 孕28 d 青紫蘭兔[南京安立默科技有限公司提供,合格證號scxk(蘇)2002- 0002] ,按1 ml•kg- 1 的3 % 戊巴比妥鈉靜脈麻醉成功后,行剖宮產(chǎn)手術(shù),取出胎兔,術(shù)畢注意保持母兔成活。采用酶消化法自胎兔顱骨分離出成骨細(xì)胞,用含20 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。消化剩余的骨組織塊采用貼塊法培養(yǎng)。
1 .2 .1 .2 成骨細(xì)胞鑒定 采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、繪制細(xì)胞生長曲線[3 ] 、細(xì)胞堿性磷酸酶染色、原代細(xì)胞匯合后繼續(xù)不傳代培養(yǎng)14d 可否形成鈣結(jié)節(jié)等4 項(xiàng)內(nèi)容進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定。1 .2 .2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定[ 4 ]對經(jīng)淋巴細(xì)胞液分離的母兔骨髓液中的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,用含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。按與成骨細(xì)胞鑒定相同的方法完成對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定。
1 .2 .3 成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)取生長良好的第3 代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與第3 代成骨細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng),培養(yǎng)條件同單獨(dú)培養(yǎng)。觀測指標(biāo)及平均值計算方法如下。
1 .2 .3 .1 細(xì)胞計數(shù) 取相同數(shù)量的成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞充分混勻后以5×104 個•孔- 1 的密度種植于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),共種植48 孔,每隔24 h 用胰蛋白酶消化6 孔,計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。各取成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以5×104 個•孔- 1 的密度種植于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)作為對照,兩種細(xì)胞各種48 孔,每隔24 h 用胰蛋白酶消化6 孔,計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。
1 .2 .3 .2 培養(yǎng)液上清中堿性磷酸酶含量測定取相同數(shù)量的成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞充分混勻后按2×105 個•瓶- 1 的細(xì)胞密度接種于50 ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),共接種12 瓶。培養(yǎng)開始后3、6、9 d 分別采用試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中堿性磷酸酶含量。各取成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與混合培養(yǎng)細(xì)胞完全相同的條件單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)。采用與上述相同的方法測定相應(yīng)指。注意在接種時預(yù)先在培養(yǎng)瓶中置入長條形玻片,使成骨細(xì)胞組、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組、混合培養(yǎng)細(xì)胞組各6 瓶細(xì)胞中置有1 塊玻片。
1 .2 .3 .3 培養(yǎng)至第7 天時細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率測定 培養(yǎng)至第7 天時細(xì)胞爬滿上述放置于培養(yǎng)瓶中的玻片,將玻片取出,行堿性磷酸酶染色,3 種細(xì)胞均各計數(shù)6 塊玻片,共600 個細(xì)胞(每塊均計數(shù)四角及
中央共5 個部位100 個細(xì)胞)。按公式:細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率= 染色陽性細(xì)胞數(shù)/600 ,分別計算出成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、混合培養(yǎng)細(xì)胞染色陽性率。
1 .2 .3 .4 單位面積細(xì)胞形成鈣結(jié)節(jié)計數(shù) 將未放入玻片的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行不傳代培養(yǎng),至21 d 時行von kossa染色,計數(shù)瓶壁四角及中央4 處共8個０.5 cm×0 .5cm 小方格內(nèi)細(xì)胞形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目,按公式:鈣結(jié)節(jié)數(shù)= 細(xì)胞在8 個小方格內(nèi)形成的鈣結(jié)節(jié)總數(shù)/8 ,求出成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、混合培養(yǎng)細(xì)胞形成的平均鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。1 .2 .3 .5 平均值的計算 除細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率為兩種細(xì)胞計數(shù)總數(shù)(染色陽性成骨細(xì)胞數(shù)+ 染色陽性骨髓基質(zhì)干細(xì)胞數(shù))外,其余各指標(biāo)的平均值計算公式均為(成骨細(xì)胞+ 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞)/2。
1 .2 .4 統(tǒng)計學(xué)處理
計量指標(biāo)的比較采用Prism 軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析,率的比較行χ2 檢驗(yàn)。
2 結(jié) 果
2 .1 成骨細(xì)胞鑒定
2 .1 .1 形態(tài)學(xué)觀察
骨組織植塊在培養(yǎng)24 h 后,即可見少量細(xì)胞從植塊邊緣爬出,培養(yǎng)2 周左右,相鄰植塊爬出的細(xì)胞可以匯合;而分離出的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 后,細(xì)胞貼壁生長呈長梭形、不規(guī)則形,培養(yǎng)10 d 左右細(xì)胞基本長
滿培養(yǎng)瓶壁,細(xì)胞相互匯合后呈明顯“鋪路石”狀。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長較快,一般接種2 h 即已貼壁,培養(yǎng)4～5 d 細(xì)胞即可長滿瓶壁,細(xì)胞形態(tài)與原代相。
2 .1 .3 堿性磷酸酶染色第1 代成骨細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染色后陽性率可達(dá)到90 % 以上。
2 .1 .4 鈣結(jié)節(jié)形成及觀察：成骨細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)至14 d 時,在培養(yǎng)瓶壁上可見到棕褐色有層次感的鈣結(jié)節(jié),經(jīng)von kossa 染色呈黑色。
2 .2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鑒定
2 .2 .1 形態(tài)學(xué)觀察
原代細(xì)胞于接種48～72 h 后開始貼壁,貼壁后細(xì)胞成三角形、紡錘形;細(xì)胞匯合后,呈條索狀、輻射狀;培養(yǎng)1 周左右細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長加快,一般接種2 h 即可貼壁,3 d 可長滿瓶壁,細(xì)胞形態(tài)與原代相同。
2 .2 .3 堿性磷酸酶染色第1 代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染色后多數(shù)呈陰性,染色陽性率約為5 %
2 .2 .4 鈣結(jié)節(jié)觀察
培養(yǎng)至14 d 時,培養(yǎng)瓶壁上可見大量細(xì)胞堆積,但未見棕褐色鈣結(jié)節(jié)形成,經(jīng)染色后亦未見到染成黑色的鈣結(jié)節(jié)。
2 .3 成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)
2 .3 .1 細(xì)胞計數(shù)培養(yǎng)開始后8 d 內(nèi)混合培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)均高于平均值( P < 0 .05)
2.3.2 培養(yǎng)液上清中堿性磷酸酶含量測定
培養(yǎng)第3、6、9 天混合培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中堿性磷酸酶含量均分別高于相應(yīng)平均值( P < 0 .05)
2 .3 .3 培養(yǎng)至第7 天時細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率測定
培養(yǎng)至第7 天時混合培養(yǎng)細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率為72 % ,明顯高于平均值52 % ( P < 0 .05)
2 .3 .4 單位面積細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成及計數(shù)
培養(yǎng)至21 d 時,混合培養(yǎng)細(xì)胞在0 .5 cm× 0 .5 cm面積內(nèi)形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目為(15 .60±2 .87)個,明顯高于平均值(9 .33±1 .03)個,兩者比較P < 0 .05。
3 討 論
3 .1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞
目前獲取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的方法主要包括梯度離心法、骨髓液稀釋后直接接種法等,本實(shí)驗(yàn)中采用梯度離心法,我們認(rèn)為該方法具有簡單易行、快速等優(yōu)點(diǎn)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,堿性磷酸酶是這一過程的標(biāo)志性酶之一[ 5 ] ,目前普遍認(rèn)為堿性磷酸酶在體外鈣化中起著關(guān)鍵性作用,即若沒有堿性磷酸酶活性,鈣化就不會發(fā)生[ 6 ] 。其主要機(jī)制在于堿性磷酸酶能夠水解有機(jī)磷酸酶使局部PO4 + 濃度升高,并可破壞鈣化抑制劑,從而啟動鈣化。在細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶升高的同時,細(xì)胞分泌也相應(yīng)增多,故通過定量測定細(xì)胞培養(yǎng)液中堿性磷酸酶的含量及細(xì)胞染色的陽性率可反映骨髓基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。
3 .2 成骨細(xì)胞
目前提取成骨細(xì)胞的主要來源是骨膜和松質(zhì)骨,培養(yǎng)方法有酶消化法和組織貼塊法。本實(shí)驗(yàn)中采用胎兔顱骨膠原酶消化法進(jìn)行成骨細(xì)胞提取,消化剩余的骨組織再采取貼塊法培養(yǎng),使胎兔顱骨得到了充分利用。成骨細(xì)胞具有分泌作用,可分泌骨形成蛋白(BMP)[ 7 ] 、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b?FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)[ 8 ] 、胰島素樣生長因子(IGF)[ 9 ]等,而目前生長因子對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用已有定論,采用成骨細(xì)胞的培養(yǎng)液提取物促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化也有文獻(xiàn)報道。
3 .3 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與成骨細(xì)胞混合培養(yǎng)的意義
骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能是其成為理想的骨組織工程種子細(xì)胞的最大障礙。在將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的問題上,現(xiàn)有的幾種方法均存在不足之處:常規(guī)誘導(dǎo)液導(dǎo)致細(xì)胞生長減慢;使用生長因子尚處于摸索階段,且生長因子昂貴的價格也限制了它的廣泛使用。因此有必要尋找一種新的誘導(dǎo)方法。
從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,在各時間點(diǎn)上,均是混合培養(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞增殖、細(xì)胞成骨能力上明顯優(yōu)于平均值。盡管混合培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量這一反映細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)尚低于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,但與平均值相比仍反映出混合培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力、成骨能力較強(qiáng)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化是目前研究的熱點(diǎn),尚無一種公認(rèn)的最佳方法,采用將成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞直接混合培養(yǎng)的方法目前尚無文獻(xiàn)報道,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)了該方法的有效性,該方法可能成為一種新的骨組織工程種子細(xì)胞獲取方法。 |
