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ELISA試劑盒使用說明書-人血管內皮細胞生長因子(VEGF165)
本試劑盒僅供體外研究使用!
預期應用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養上清或其它相關生物液體中VEGF165含量。
實驗原理
用純化的VEGF165抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的VEGF165抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的VEGF165呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1、 酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋
好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5,000 pg/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml。如配制2,500 pg/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）5,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
6、 檢測溶液A：1×120/瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10檢測
溶液A / 990檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量
配制（100/孔），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。
7、 檢測溶液B：1×120/瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢
測溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5張
12、使用說明書：1份
自備物品
1、 酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）
2、 微量加液器及吸頭，EP管
3、 蒸餾水或去離子水，濾紙
標本的采集及保存
1、 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可
檢測，或將上清置于-20或-80保存，但應避免反復凍融。
2、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于 1000g離心15分鐘，
取上清即可檢測，或將上清置于-20或-80保存，但應避免反復凍融。
3、 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20或-80保存，但應避免反復凍融。
注：以上標本均應密封保存，4保存應小于1周，-20不應超過1個月，-80不應超過2個月；標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37溶解）；試劑或樣品配制時，
均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。
1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100，余孔分別加
標準品或待測樣品100，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及
孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37溫育2小時。為保證實驗結果有效
性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100（臨用前配制），酶標板加
上覆膜，37溫育1小時。
3、 棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400/每孔，甩干（也可輕
拍將孔內液體拍干）。
4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制） 100，加上覆膜，37溫育1小時。
5、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90，酶標板加上覆膜37避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當
標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。
7、 每孔加終止溶液50，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物
液的加入順序相同。
8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。
實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2、 加樣：加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不
同的 “預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間（包括標準
品及所有樣品）最好控制在10分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。
3、 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發；
洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態；同時應嚴格遵守給
定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中
吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數。
5、試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁
或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需
的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請精確配制標準品及工作液，盡
量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10），以避免由于不準確稀釋
而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B
工作液。
6、反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如
顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
洗板方法
1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，吸去（不可
觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾
次；根據需要，重復此過程數次。
2、 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人VEGF165，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
各標準品O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖（七點圖），如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數坐標）， O.D.值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品的O.D.值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
檢測范圍：78 pg/ml - 5,000 pg/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值：5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml。
最低檢測限：20 pg/ml
說明
1、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和微生物的
污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。
2、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20，其余試
劑短期保存請置于4，長期保存則置于-20。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于
-20，避免潮濕。
3、 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4、 剛開啟的酶聯板孔中可能會有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
5、 有效期：6個月。
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