一、標(biāo)本的采集和儲(chǔ)存
出現(xiàn)癥狀后72小時(shí)內(nèi)采樣。
糞便量盡量不少于5ml。
貯存于2～8℃，但最多不能超過3天；長(zhǎng)期貯存應(yīng)在－20℃或－70℃。
成形便和肛拭子診斷意義較小。
二、所需材料
IDEIA™ norovirus試劑盒（DakoCytomation公司）
1000µl和200µl微量加樣槍及相應(yīng)不帶濾芯的槍頭
酶標(biāo)儀
洗板機(jī)
吸水性能好的衛(wèi)生紙
去離子水(無須高壓)或蒸餾水
渦漩震蕩器
離心機(jī)
50ml管、1.5ml EP管及相應(yīng)的架子
三、檢測(cè)前準(zhǔn)備
將試劑和待檢測(cè)標(biāo)本置于室溫（15～30℃）30min。
陰性對(duì)照：將1ml樣品稀釋液（sample diluent）加至標(biāo)記好的小瓶中作為陰性對(duì)照。
陽性對(duì)照：1ml陽性對(duì)照液（positive control）溶解一瓶陽性對(duì)照， 顛倒混勻。未用完的陽性對(duì)照可在2～8℃貯存1個(gè)月，長(zhǎng)期貯存應(yīng)分裝存于-20℃。
每次檢測(cè)均至少一個(gè)陽性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照。
空白對(duì)照：空氣
洗液的配制：1倍體積的洗液濃縮液（WASH BUFFER×25）加24倍體積的去離子水，當(dāng)天用當(dāng)天配。
四、標(biāo)本準(zhǔn)備
加入1ml樣品稀釋液至1.5ml 小離心管中，然后，加入0.1g固體糞便標(biāo)本或0.1ml液體糞便標(biāo)本，置于漩渦震蕩器充分混勻，室溫靜置10min，室溫下≥5000rpm離心5min，取上清進(jìn)行檢測(cè)或置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
五、檢測(cè)步驟
1、將需要數(shù)量的微孔板置于微孔板架上。
2、每孔加入100µl 10％便懸液以及陰性對(duì)照，陽性對(duì)照。
3、每孔加入2滴（或100µl）酶結(jié)合物（conjugate），用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），20～30℃靜置60±5min。
4、每孔加入350µl洗液（用手輕微搖動(dòng)1 min左右），棄去洗液，在衛(wèi)生紙上拍干，共洗5次。
5、每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃靜置30min。待藍(lán)色顯現(xiàn)后迅速觀察顏色。
6、每孔加入2滴（或100µl）終止液（Stop solution），充分混勻。
7、讀取OD450值，打印輸出或記錄值。結(jié)果必須在加入終止液后30min內(nèi)讀取。
六、結(jié)果判定
陰性對(duì)照：肉眼觀察無色或OD450值<0.15。
陽性對(duì)照：肉眼觀察呈現(xiàn)獨(dú)特的藍(lán)色或OD450值>0.50。
臨界值（cut-off value）：OD450值＝陰性對(duì)照OD450值＋0.10。
標(biāo)本：
a)肉眼觀察藍(lán)色比陰性對(duì)照顏色深判定為陽性，肉眼觀察無色判定為陰性。
b)OD450值大于臨界值判定為陽性，小于臨界值判定為陰性，OD450值在臨界值±0.01
范圍內(nèi)判定為可疑，應(yīng)重復(fù)檢測(cè)或重新取樣。判斷陰陽結(jié)果按上述方法進(jìn)行。若OD450值在臨界值仍在±0.01范圍內(nèi)，仍判定為可疑，對(duì)于可疑樣品應(yīng)用PCR方法來判定最終結(jié)果。
七、注意事項(xiàng)
1、便標(biāo)本處理時(shí)震蕩時(shí)應(yīng)充分震蕩，特別是成形便或稀便，以便于病毒從標(biāo)本中釋放出來。
2、加酶結(jié)合物（conjugate）后應(yīng)用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），以便于抗原抗體充分結(jié)合。
3、讀取吸光度應(yīng)在加完終止液之后30min內(nèi)完成。
4、所有標(biāo)本和陽性對(duì)照必須被當(dāng)作具有潛在感染性的物質(zhì)進(jìn)行處理。
5、打開后的96微孔板應(yīng)置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2～8℃，打開后6周內(nèi)用完。
6、終止液中含0.46mol/L硫酸，避免接觸到皮膚和眼睛。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗。
7、底物液避光保存，不使用已經(jīng)變藍(lán)的底物液。
8、避免試劑、金屬離子、氧化性物質(zhì)及微生物污染。
9、因標(biāo)本中可能存在某些腺病毒，該病毒具有與眼結(jié)膜結(jié)合的能力，在檢測(cè)過程中應(yīng)避免手與眼的接觸。
10、ELISA板微孔不能反復(fù)使用。
|
