劉云浩1,2，藍(lán)江林2，劉波2*，朱昌雄1，陳燕萍2
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003）
發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料是以谷殼、鋸末、豬糞便加益生菌夠成的發(fā)酵物，類似土壤，但又有區(qū)別于土壤，由于沒有專門對(duì)應(yīng)豬墊料DNA提取的試劑盒以及相應(yīng)比較成熟的提取方法。故本采用試劑盒和相關(guān)文獻(xiàn)的方法作為參考，對(duì)墊料總DNA的提取進(jìn)行摸索。
樣品采集自中國(guó)人民解放軍73121部隊(duì)福建福州新店養(yǎng)豬場(chǎng)，墊料使用時(shí)間3-5個(gè)月。分別采用土壤總DNA提取試劑盒法、糞便總DNA提取試劑盒法、淤泥總DNA提取試劑盒法、SDS法、CTAB 法和SDS-CTAB結(jié)合法提取養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物總DNA，對(duì)6種方法提取的DNA的濃度和純度進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。
采用土壤總DNA提取試劑盒法提取四種墊料的DNA，所得到的DNA濃度最低，質(zhì)量也很低，并且純度也很低，A260/A280為2.0左右甚至更高，A260/A230為 0.3左右；糞便試劑盒提取法提取的DNA濃度最高，但是DNA質(zhì)量和純度不夠高，A260/A280為1.5左右，A260/A230為0.3左右；淤泥總DNA提取試劑盒法只有A1的微生物總DNA純度比較好，但濃度較低，A260/A280為1.5左右，A260/A230為 0.5左右；SDS法和CTAB法得到的DNA雖然濃度都很高，但是純度都太低；只有SDS-CTAB結(jié)合法所提取的純度最高，而且濃度也較高，A260/A280為1.8左右，A260/A230在 1.4以上。由于土壤總DNA提取試劑盒法所提取的DNA質(zhì)量和濃度都很低，16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增之后沒有目的條帶出現(xiàn)；而糞便試劑盒法，SDS法以及CTAB法提取的DNA含有大量的腐殖酸，并呈現(xiàn)出黃褐色，嚴(yán)重影響后續(xù)的PCR，以至于擴(kuò)增不出目的條帶；雖然淤泥總DNA試劑盒法提取的DNA純度要高于上面的幾種方法，但是提取的DNA也還是會(huì)呈現(xiàn)出淡黃色，所以在后續(xù)PCR時(shí)也只有一種墊料的DNA擴(kuò)增出了目的條帶，這對(duì)于不同發(fā)酵程度的墊料來講，沒有針對(duì)性；而SDS-CTAB法所提取的四種發(fā)酵程度不同的墊料的DNA都具有很高的純度，DNA溶液比較清澈透明，直接DNA電泳能得到比較單一的條帶，后續(xù)的PCR也能擴(kuò)增出比較亮的目的條帶。
綜合分析表明，試劑盒法因?yàn)闆]有專門針對(duì)本實(shí)驗(yàn)墊料的DNA提取試劑盒，所采用糞便，土壤以及淤泥試劑盒都沒有達(dá)到很好的效果，而在化學(xué)法當(dāng)中，單純的SDS法和CTAB法都不能有效除去腐殖酸和雜蛋白的污染，只有SDS-CTAB結(jié)合法提取的DNA具有完整性好，純度高，不需要純化直接就可用于PCR擴(kuò)增，有利于進(jìn)行下游的分子生態(tài)學(xué)研究。
關(guān)鍵詞：墊料微生物 DNA提取 SDS-CTAB 16SrDNA
基金項(xiàng)目：國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)（2008ZX07425-002）；國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2008BAD96B07）；福建省發(fā)改委項(xiàng)目（閩發(fā)改投資[2008]762號(hào)）；福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2010R1020-1）。
作者簡(jiǎn)介：劉云浩（1988-），男，碩士研究生。研究方向：應(yīng)用微生物，E-mail：1988yh@gmail.com
* 通訊作者：劉波（1957-），男，博士，研究員，研究方向：微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物。E-mail：liubofz@163.com.
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