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小鼠生物發(fā)光活體成像
（一）技術(shù)原理 1.標記原理 哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強度與標記細胞的數(shù)目線性相關(guān)。 除Firefly Luciferase外，有時也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長不一樣，前者所發(fā)的光波長在540~600nm，后者所發(fā)的光波長在460~540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用Firefly Luciferase作為報告基因，如果需要雙標記，也可采用后者作為備選方案。 熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。 2.底物熒光素的特點 熒光素由于諸多優(yōu)點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下： (1)熒光素不會影響動物的正常生理功能。 (2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。 (3)熒光素在體內(nèi)擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內(nèi)。腹腔注射擴散較慢，持續(xù)發(fā)光長。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，10min后強度達到穩(wěn)定的最高點，在最高點持續(xù)約20~30 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，最佳檢測時間是在注射后15~35min之間；若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發(fā)光持續(xù)時間很短。科研人員根據(jù)大量的實驗總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。 (4)觀察時間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內(nèi)有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結(jié)果的影響。 3.光學原理 光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發(fā)光成像技術(shù)最少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細胞數(shù)是不同的。一般認為，每一厘米深度，發(fā)光強度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系，可由儀器量化檢測到的光強度，反映出細胞的數(shù)量。
（二）小鼠生物發(fā)光活體成像技術(shù)特點
（四）實驗操作流程 1.腫瘤細胞標記 首先用螢光素酶標記所要研究的腫瘤細胞，我們利用帶luciferase基因，puromycin或blasticidin抗性的慢病毒載體，先包裝成慢病毒，然后感染腫瘤細胞，最后抗性篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)luciferase的腫瘤細胞。接下來可以繼續(xù)按照客戶需求對該穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株進行其它基因改造操作。 2.體外預實驗檢測 需要檢測的腫瘤細胞標記后，在活體成像前，可以通過檢測熒光素酶的表達強度，繪制標記細胞的發(fā)光梯度曲線等。體外預實驗是作為小動物活體成像解決方案中不可缺少的一部分。比如，利用體外預實驗初步檢測轉(zhuǎn)染熒光素酶的腫瘤細胞發(fā)光值。 3.穩(wěn)轉(zhuǎn)luciferase細胞接種小鼠 接種方式按照實驗目的不同有幾種，原位接種，皮下接種，腹腔接種以及靜脈接種，可分別觀察原位瘤，皮下瘤以及轉(zhuǎn)移瘤等。如果是人源的腫瘤細胞，必須用裸鼠作為受體，如果是鼠源細胞系則無所謂，但是前提是所用細胞必須能成瘤。 4.活體成像 細胞接種一段時間后，可以進行活體成像檢測。首先麻醉實驗動物，可采用異氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉實驗動物。 接著注射底物熒光素，最佳的檢測時間是在注射后10到35分鐘之間。但需要注意的是，對于不同的動物模型，發(fā)光動力學過程并不完全一致，最好先進行預實驗確定何時發(fā)光信號最強。
（五）北京畢特博生物技術(shù)有限責任公司穩(wěn)轉(zhuǎn)luciferase細胞株列表
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