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引言
自然殺傷（NK）細胞在識別和殺死腫瘤和病毒感染的先天免疫和后天免疫反應中扮演著關鍵的角色。因此，已有許多研究嘗試研發在體外激活和擴增NK細胞的方法，以用于和免疫細胞相關研究，而目前的方法包括使用細胞因子、誘導因子以及飼養細胞1，其中細胞因子在調節NK細胞的活性中具有核心作用。據報道，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ被歸類為NK細胞的細胞毒性 和增殖的活化細胞因子，能夠增強NK細胞對各種腫瘤的細胞毒性作用2。然而，這些激活NK細胞的細胞因子組合仍需研究人員進一步優化。 康寧NK無血清培養試劑盒II中含有1瓶1 mL的包被培養基，1瓶50 mL的激活培養基，1瓶1,000 mL的擴增培養基和1個透氣性細胞培養袋。前兩個試劑專用于NK細胞的初期激活培養，擴增培養基和細胞培養袋則用于NK細胞后期擴增培養。NK激活培養基和擴增培養基均采用優質的試劑和符合目前的良好生產規范（cGMP）要求的原料制造。培養基中的蛋白質是可注射等級的血清白蛋白和重組人胰島素。
NK培養試劑盒組分的應用概述
激活培養基：NKCC-1＋10%自體血漿（滅活） 擴增培養基：NKCC-2或NKCC-2＋5%自體血漿（滅活） 激活培養瓶：T-75培養瓶 （自備）+NKCC-3包被培養基 擴增培養瓶：可透氣細胞培養袋或T-225培養瓶 （自備）
試劑和材料
淋巴細胞分離液（LSM，康寧目錄編號：25-072-Cl） 不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽（PBS），1×（500 mL）（康寧目錄編號：21-040-CV） T-75培養瓶（康寧目錄編號：353024） T-225培養瓶（康寧目錄編號：431082）
NK細胞的激活和擴增
包被T-75培養瓶（開始細胞培養的前1天） 1. 向15 mL離心管中加入13 mL的PBS及1 mL的NKCC-3用來制備包被培養基。 2. 將所有的包被培養基（14 mL）轉移至T-75培養瓶中。 3. 將預包被的培養瓶在37℃下孵育4小時或置于冰箱（2-8℃）中隔夜孵育。 4. 使用T-75培養瓶前先使用移液槍棄掉包被培養基，再用PBS潤洗兩次。 5. 將T-75培養瓶置于室溫下風干15分鐘。
制備PBMC（第1天） 1. 將經抗凝處理的血液在室溫下以400 ×g離心10分鐘后，將血漿（上清液層）轉移到新的離心管中。 2. 將自體血漿在56℃下加熱滅活30分鐘后于800 ×g下離心20分鐘以去除沉淀物，將上清液血漿儲存于4℃下，存儲的自體血漿在接下來10天的細胞培養中使用。 3. 在血液樣本中加入等體積的PBS作為已被丟棄的自體血漿的代替品用以維持細胞懸浮液的體積， 然后輕輕地重懸血液。 注意：在PBS中預先添加0.1％人血清白蛋白（HSA）有助于維持血細胞的活力。 4. 根據說明書使用淋巴細胞分離液（LSM）將外周血單個核細胞（PBMC）從上述血液樣本中分離。注意：需采用新鮮的人體血液（收集后2小時內）以獲得具更好的活性;請勿使用超過24小時抽取的血液。 5. 將PBMCs用含至少5xPBS（不含鈣和鎂）的體積洗滌后，在室溫下于500 ×g離心10分鐘，收集PBMCs。 注意：使用LSM可從1 mL的新鮮外周血中提取1x106個細胞；本NK細胞培養流程需要30 mL的外周血。
NK細胞的激活培養（第1-7天） 1. 在實驗第1天向30 mL的NKCC-1培養基中加入自體血漿至最終濃度為10％，以制備激活培養基。 2. 將PBMCs懸浮于20 mL的激活培養基（含10％自體血漿的NKCC-1培養基）中，并將細胞密度調整為1×106個細胞/mL。 3. 將20 mL的PBMCs懸液轉移至預先包被的T-75培養瓶后，放置在5% CO2，37℃的培養箱中培養2-3天。 4. 第3天或第4天根據PBMCs的細胞狀態來添加10 mL的激活培養基，持續培養2天。 5. 在第6天將所有（30 mL）的PBMCs懸液收集到50 mL的離心管中，并在800 xg下離心5分鐘。 6. 吸除上清液后向細胞培養袋中加入適量（例如130 mL）的含5％自體血漿的NKCC-2培養基， 并將細胞密度調整為5×105個細胞/mL后進行孵育培養。 注意：若加入的培養基體積小于100 mL，則將細胞培養于在T-75培養瓶中；若加入的培養基體積超過100 mL，則需將細胞轉移至細胞培養袋或T-225培養瓶中培養。
NK細胞的擴增培養（第8-11天） 1. 每2到3天檢測細胞的密度及活率，并根據細胞增殖狀態加入新鮮的NKCC-2培養基，將細胞密度維持在5×105個細胞/mL的水平。 注意：建議在NK細胞擴增期間添加的新鮮培養基中補充0.5％至1％的自體血漿，直至其耗盡為止。 2. 第11天將NK細胞收集后進行細胞計數和流式細胞分析。 注意：若后續實驗需要更高的細胞數量，可添加新鮮的581淋巴細胞無血清培養基（康寧目錄編號:88-581-CM）來延長細胞的培養期。
參考文獻
1. Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500. 2.Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.
北京畢特博生物技術有限責任公司
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