【目錄號】RAL48TS，RAL48T
【名稱】
通用名稱：內毒素檢測試劑盒（基因重組熒光法）
英文名稱：BioendoTM Recombinant Factor C Endotoxin Test Kit (Fluorescent Assay)
【用途】
用于體外檢測革蘭氏陰性細菌內毒素。不可用于疾病診斷。
【檢測原理】
基因重組熒光法采用《中國藥典》2020年版注射劑安全性檢查法應用指 導原則“重組C因子法”檢測細菌內毒素。使用基因重組技術，在真核 細胞表達鱟血細胞中與內毒素起反應的絲氨酸蛋白酶催化級聯蛋白。其 中重組C因子與內毒素結合之后，由無活性的蛋白酶原轉變成具有生物 活性的蛋白酶，識別并催化下游熒光底物產生熒光信號。熒光信號的強 度和內毒素濃度成正相關，通過與標準曲線的比較，計算出樣品中內毒 素的濃度。
【儲存條件及有效期】
2-8℃保存，有效期兩年。
【注意事項】
（1） 該試劑盒用于體外細菌內毒素的定量檢測，嚴禁用于檢測臨床樣本內毒素或作為診斷人類疾病的輔助工具，嚴禁試劑以任何途徑進入機 體。
（2） 接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的，玻璃器皿和材料可以250℃，30分鐘滅菌處理。試驗過程應防止微生物的污染。
（3） 該說明書中的無熱原指內毒素濃度小于0.001 EU/ml。
（4）供試品溶液和重組因子試劑混合后溶液的pH值應在6.0~8.0之間， 若超出此范圍，需用無熱原的緩 沖液、0.1N氫氧化鈉或0.1N鹽酸調節。
（5）塑料管不建議用于內毒素稀釋，稀釋的內毒素溶液靜置時間超過 10分鐘，用前在旋渦混合器上劇烈振搖1分鐘，放置4小時以上的內毒素 溶液應丟棄。
（6） 重組因子試劑必須用配套的檢測緩沖液溶解；不要用旋渦混合器劇烈振搖；溶解的重組因子試劑應在10分鐘內使用；若采用多道移液器， 將溶解的重組因子試劑轉移到無熱原加樣槽，并輕輕搖勻。
（7） 檢測軟件相關參數可以根據《質檢報告》進行設定，也可以根據實際情況在范圍內進行調整，以給出標準曲線的相關系數最佳為宜。
【樣本采集和保存】
樣本采集時必須小心操作以避免微生物或內毒素污染。試驗所用的器皿 需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法
（250℃、30分鐘以上）去除，也可采用其他確證不干擾細菌內毒素檢查 的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭 等，應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器具。
樣本應儲存于細菌不會繁殖或內毒素水平不會改變的條件下。比如，樣 本可以2~8℃臨時存儲（不到24小時），或-10℃以下長期存儲（24小時 以上）。適當的容器和存儲條件需用戶自行驗證。
【供試品溶液的制備】
某些樣本需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要 時，可調節被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和重組因 子試劑混合后溶液的pH值在6.0~8.0的范圍內為宜，可使用適宜的酸、 堿溶液 或緩沖液調節pH值。酸或堿溶液須用細菌內毒素檢查用水在已去
除內毒素的容器中配制。緩沖液必須經過驗證不含內毒素和干擾因子。
【內毒素限值的確定】
藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：
L= K / M
式中 L為供試品的細菌內毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示； K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表 示，注射劑K=5 EU/（ kg·h），放射性藥品注射劑K=2.5 EU/（kg·h）， 鞘內用注射劑K=0.2EU/（kg·h）； M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按 1.62m 計算。注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積2 劑量乘以0.027即可轉換為每千克體重劑量（M）。
按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。
【確定最大有效稀釋倍數（MVD）】
最大有效稀釋倍數數是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數（1→MVD），在不超過此稀釋倍數的濃度下進行內毒素限值的檢 測。用以下公式來確定MVD：
MVD = c L /λ
式中 L為供試品的細菌內毒素限值；
c為供試品溶液的濃度，當L以EU/mg或EU/U表示時，c的單位需為mg/ml或U/ml，當L以EU/ml表示時，則c等于1.0ml/ml。如需計算在MVD時的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L； λ為所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。
【用法】
1. 試劑與器材
1.1 試劑
重組因子試劑、檢測緩沖液、細菌內毒素工作標準品、細菌內毒素檢查用水。
1.2 器材：
無熱原試管、無熱原吸頭、無熱原96孔微孔板（或可拆式板條）； 旋渦混合器、移液器、試管架；
帶溫育系統的熒光微孔板讀數儀器及配套軟件。
2. 實驗方法 2.1熒光測定儀器的程序及模板設定
以熒光微孔板讀數儀FLUOROSKAN為例： (1)溫度設定：孵育溫度37ºC。 (2)振板設定：中速、振板15秒
(3)讀數波長設定：當使用熒光微孔板讀數儀FLUOROSKAN時，推薦使用激發波長355nm/發射波長460nm。讀取反應開始和30分鐘時的熒光信號儀。
2.2 內毒素標準溶液配制
為了計算未知樣品中內毒素濃度，每個試驗必須引用一個有效的標準曲線。
用標準內毒素配成溶液，制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得大于10），最低濃度不得低于所用重組因子試劑的標示檢測限。
（1）取細菌內毒素工作標準品1瓶，開啟后加入適量細菌內毒素檢查用水，置旋渦混合器上劇烈振搖15分鐘，配制濃度為50EU/ml的內毒素標準品溶液。
（2）取無熱原試管4支并標記，細菌內毒素檢查用水作稀釋液，將50EU/ml的內毒素標準品溶液依次梯度稀釋，配制為5.0EU/ml、0.5EU
/ml、0.05EU/ml和0.005EU/ml等4個濃度。各個濃度內毒素標準品稀釋液配制時，均應在旋渦混勻器上混勻至少1分鐘。內毒素標準品稀釋液的配制可參考下表：
|
內毒素濃度
（EU/ml）
|
稀釋液體積
（ml）
|
加入內毒素濃度
（EU/ml）
|
加入內毒素體積
（ml）
|
|
5.0
|
0.9
|
50
|
0.1
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|
0.5
|
0.9
|
5.0
|
0.1
|
|
0.05
|
0.9
|
0.5
|
0.1
|
|
0.005
|
0.9
|
0.05
|
0.1
|
上表提出了一種適用于試劑盒的細菌內毒素工作標準品配制系列濃度內毒素標準品溶液的方案。并非所有的內毒素標準品溶液都必須用于生成標準曲線。可以使用替代稀釋方案，也可以使用其他確定效價的內毒 素。用戶可以根據具體的產品需求選擇標準曲線范圍。數據表明，特定范圍標準曲線可以提高測試樣本內毒素預測值的準確性。
2.3 重組因子試劑溶解
重組因子試劑是由真核細胞表達的重組因子蛋白和熒光基質制備的冷凍干燥品。使用前，每瓶重組因子試劑必須按標示量用配套的檢測緩沖 液。如果使用量超過一瓶，將兩瓶或更多瓶分別復溶，混合后輕輕搖 勻，靜置至溶液澄清后使用。
2.4 實驗操作
（1）預熱熒光微孔板讀數儀FLUOROSKAN，設置檢測溫度為 37℃。
（2）取無熱原黑色微孔板或所需數量的黑色微孔板條，微孔板條裝至 微孔板架上。相應孔中分別加入細菌內毒素檢查用水（作為陰性對 照）、內毒素標準品溶液或稀釋液，供試品溶液等各100μl，分別2~3個重復。
（3） 微孔板放入預熱的熒光微孔板讀數儀FLUOROSKAN中， 37℃孵育至少10分鐘。
（4） ） 取出微孔板， 每孔小心加入50μl重組因子試劑（避免產生氣泡!）。
（5） 將微孔板放入熒光微孔板讀數儀FLUOROSKAN中（不要蓋上微孔 板蓋！），點擊檢測軟件界面“確定”按鈕，運行檢測程 序。
（6）檢測程序結束后，進行數據處理和數據分析。
3. 數據處理
（1）設定讀數之前震蕩15s，隨后靜置孵育3min；讀數之后，孵育總時長30min；
（2）設定激發波長355nm，發射波長460nm。
（3）建立標準曲線
Lg（Y）= A* lgB +a，其中：Y為30min中熒光值減去起始的熒光值，B 為內毒素的濃度，A為直線斜 率，a為Y軸截距。
（4）使用軟件可以線性回歸自動計算出結果。
（5） 如果線性相關系數|r|≥0.980，則可以建立多項式模型制作標準 曲線，計算樣品內毒素濃度。
（6）當實驗數據同時滿足如下三個條件時實驗才有效：
① 標準曲線的濃度點≥3，線性相關系數|r|≥0.980；
② 標準曲線最低點的熒光值大于陰性對照的熒光值；
③ 供試品平行管的平均值在標準曲線的區間內。
【供試品的干擾試驗】
1. 以下情況需進行供試品的干擾實驗：
（1）當對新藥或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，必須進行干擾試驗；
（2）當試劑、供試品的來源、配方、生產工藝改變，或試驗環境中發 生了任何有可能影響試驗結果的變化時，必須重新進行干擾試驗；
（3）當供試品中可能存在對內毒素檢測試驗的干擾物質時，須進行干擾試驗。
2. 干擾實驗：
（1）選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度（設為λm），作為供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度，如采用標準曲線為50，5， 0.5，0.05，0.005EU/ml系列時，可以用供試品配制0.5EU/ml內毒素濃 度作為實驗的供試品陽性對照。
（2）用供試品溶液配制濃度為λm的內毒素溶液（即含λm內毒素的供
試品陽性對照），測量出該溶液的內毒素濃度，稱為Cs。
（3）測量出未添加外源內毒素的供試品溶液內毒素濃度, 稱為C t。
（4）計算該試驗條件下的回收率：R =（Cs –Ct ）/ λm × 100％。
（5）當R在50％～200％之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在明顯干擾作用。
（6）當R在50％～200％之外，需對供試品進行系列稀釋或進行其它處 理消除干擾，每一稀釋溶液都重復步驟2~4，直到內毒素的回收率在50％～200％之間。選擇回收率最接近100％的稀釋倍數進行內毒素檢 測。
【參考文獻】
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8. 2020年版《中華人民共和國藥典》—— 1143細菌內毒素檢查法
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